Análisis de la expresión de miRNA circulantes en pacientes con infarto agudo de miocardio y su relación con citoquinas. Repercusión funcional en cultivos de células endoteliales humana.

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Publication date
2019
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04-03-2019
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Las enfermedades cardiovasculares, en concreto el síndrome coronario agudo (SCA), son la principal causa de muerte en hombres y mujeres en todo el mundo. El SCA es la manifestación clínica de la isquemia miocárdica, producida por la reducción del aporte sanguíneo al miocardio como consecuencia de una disminución del calibre de las arterias coronarias. La enfermedad subyacente al SCA más frecuente es la aterosclerosis, un proceso inflamatorio iniciado por la acumulación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en el espacio subendotelial en arterias de mediano y gran calibre a lo largo del sistema cardiovascular. El primer cambio funcional detectable en la lesión aterosclerótica es la disfunción endotelial provocada por la modificación mediante oxidación y agregación de las LDL que estimulan una respuesta inmune innata y adaptativa, dando lugar a la activación del endotelio. El endotelio activado induce la expresión de moléculas de adhesión y quimioquinas, dando lugar a la adhesión de monocitos y a su migración a través de la pared vascular, donde se diferencian a macrófagos y células dendríticas. Conforme avanza el proceso inflamatorio, se genera una capa fibrosa, cuya rotura es la causa más frecuente de trombosis coronaria. El trombo puede ocluir parcial o totalmente la arteria coronaria, dando lugar a la isquemia miocárdica y necrosis del tejido perfundido por esa arteria. Como consecuencia de esta necrosis, se desencadena una respuesta inflamatoria sistémica inicial que posteriormente es suprimida, en parte, por citoquinas antiinflamatorias, dando lugar a la transición desde la inflamación a la reparación cardiaca. Por tanto, la inflamación ejerce un papel central en la fisiopatología del SCA. La sintomatología clínica no permite una diferenciación precisa de los diferentes síndromes, por lo que es imprescindible la realización de un electrocardiograma (ECG), cuyos resultados permiten agrupar a los pacientes con SCA en dos grandes grupos: infarto agudo de miocardio con elevación del segmento ST (IAMCEST) y aquellos que no presentan una elevación del ST (SCA sin elevación del segmento ST, SCASEST). Éste último término (SCASEST) hace referencia tanto al infarto agudo de miocardio sin elevación del ST (IAMSEST) como a la angina inestable. La necrosis de cardiomiocitos asociada al daño cardiaco provocado por el SCA da lugar a la liberación de proteínas a la circulación, como las troponinas I y T (cTnI y cTnT) que actualmente se utilizan como biomarcadores de necrosis miocárdica de referencia. Por lo tanto, en el diagnóstico de los diferentes síndromes, se complementa el resultado del ECG con la medida plasmática de cTnI o cTnT. De esta manera, los pacientes IAMCEST (elevación del segmento ST y con aumento de troponinas cardiacas) son diagnosticados con certeza y precocidad. La medida de las troponinas cardiacas es asimismo un aspecto importante en el diagnóstico de los pacientes IAMSEST, ya que no muestran una elevación del ST pero sí una elevación de troponinas en sangre. Sin embargo, su uso en el diagnóstico de pacientes con angina inestable no está tan claro, ya que no muestran elevación del ST y tampoco un aumento de troponinas dificultando un diagnóstico temprano. Es probable que el tejido cardiaco dañado genere una liberación de RNA no codificantes (ncRNA), entre ellos microRNA (miRNA), similar a la liberación de troponinas cardiacas. Los miRNA son pequeñas moléculas monocatenarias (19-23 nt) de RNA no codificante que desempeñan importantes funciones en la regulación postranscripcional de la expresión génica. El interés actual en los miRNA circulantes radica en la posibilidad de utilizarlos como biomarcadores clínicos para distintas enfermedades, entre ellas las cardiovasculares. Sin embargo, la falta de estandarización de los métodos pre-analíticos y analíticos, ha derivado en la imposibilidad de comparar los diferentes estudios publicados. El resultado de estas dificultades metodológicas es la falta de consenso sobre el potencial de los miRNA como biomarcadores de SCA. El suero y el plasma son los tipos de muestra más frecuentemente utilizados en los estudios de expresión de miRNA circulantes. Sin embargo, el tipo de muestra de partida podría ser una fuente de variación en el análisis del perfil de miRNA circulantes en SCA. Por ello, el primer objetivo de este estudio ha sido determinar las diferencias en la concentración de miRNA en suero y plasma y si bien, la fracción de miRNA entre suero y plasma era similar, los pacientes con SCASEST presentaron concentraciones de miRNA más elevadas que las muestras de sujetos sanos. Entre las dificultades metodológicas del análisis de la expresión de miRNA circulantes mediante qRT-PCR también se encuentra la normalización de los valores de expresión. Por ello, para seleccionar un control endógeno adecuado para nuestros estudios de qRT-PCR en muestras de suero y plasma de pacientes con SCASEST e individuos sanos, analizamos la expresión de los miRNA circulantes utilizados como controles endógenos en diferentes estudios. El miR-484 resultó ser el miRNA que, además de no mostrar diferencias significativas entre suero y plasma en nuestra muestra, tampoco mostró diferencias en los coeficientes de variación. Por lo tanto, los valores de expresión de los miRNA de este estudio fueron normalizados tomando como referencia la expresión de miR-484. Por otra parte, suero o plasma podrían influir en el nivel de expresión de miRNA circulantes en pacientes con SCA y para determinarlo, analizamos la expresión de miRNA que previamente habían sido descritos como posibles biomarcadores de SCA. De hecho, el patrón de expresión de los miRNA resultó ser diferente en suero y plasma y también se observaron diferencias en la variabilidad de expresión. El suero ofreció una mayor sensibilidad en la detección de miRNA y una menor variabilidad en la expresión, sugiriendo que el tipo de muestra más adecuado para realizar estudios de miRNA circulantes en pacientes con SCA es el suero. La desregulación de la biogénesis de miRNA se ha asociado a diversas enfermedades cardiovasculares. Numerosos estudios han descrito diferentes patrones de expresión de miRNA en el SCA, especialmente en pacientes IAMCEST, sugiriendo su posible uso como herramientas moleculares para su diagnóstico y pronóstico. Sin embargo, debido a la mayor incertidumbre a la hora de diagnosticar pacientes con SCASEST (IAMSEST y angina inestable), el análisis del patrón de expresión de miRNA circulantes en este tipo de pacientes sería de especial interés, siguiente objetivo de este estudio. Para ello, mediante arrays de expresión analizamos el perfil de miRNA de pacientes con SCASEST en su manifestación aguda y también después de un año de evolución clínica, para determinar los miRNA relacionados directamente con el momento agudo del infarto. Se observó una desregulación de 54 miRNA en el momento agudo del SCA, de los que 10 aumentaron y 44 disminuyeron su expresión. Después de un año de evolución clínica, había 42 miRNA desregulados, de los que 35 aumentaron y 7 disminuyeron su expresión. Con la finalidad de identificar los miRNA que podrían estar relacionados con el momento agudo del infarto, se seleccionaron del array aquellos miRNA cuya expresión variaba en la manifestación aguda del SCA y revertía a niveles control después de un año de evolución clínica. Estos miRNA se comprobaron posteriormente en una población de SCASEST más amplia y se confirmó la desregulación de la expresión de let-7e, miR-28, miR-130b, miR-523, miR-874, miR-92a, miR-26a y miR-320b en suero de pacientes con SCASEST en su manifestación aguda. De ellos, la expresión de let-7e y miR-26a revirtió hasta niveles control tras un año de evolución clínica. El miRNA let-7e forma parte del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a y para comprobar si estos miRNA se comportaban de manera coordinada, también analizamos la expresión de miR-99b y miR-125a. Al igual que let-7e, la expresión de miR-99b y miR-125a disminuyó en suero de pacientes con SCASEST en su manifestación aguda, revirtiendo a niveles control después de un año de evolución clínica. La comunicación intercelular a través de miRNA circulantes es especialmente importante para las células endoteliales, donde se ha descrito una alta expresión del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a. Sin embargo, se desconoce su papel en la biología vascular. Por ello, después de comprobar los niveles circulantes del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a en pacientes con SCASEST, estudiamos su implicación en la modulación de la función endotelial en cultivo celular. Para ello, utilizando células endoteliales de vena umbilical humana, HUVEC, se realizaron transfecciones con inhibidores y mímicos de los 3 miRNA del cluster, analizando su capacidad funcional mediante estudios de adhesión, proliferación y vasculogénesis. Sólo el let-7e y miR-125a tuvieron efectos sobre la función endotelial. Las células transfectadas con el mímico de let-7e incrementan su capacidad de adhesión y con el inhibidor de let-7e aumentan la vasculogénesis, mientras que la transfección celular con el inhibidor de miR-125a disminuye la proliferación celular. También se ha demostrado la contribución de los miRNA en gran variedad de procesos biológicos incluyendo la disfunción endotelial y la inflamación vascular, y la inflamación tiene un papel destacado en la patogénesis del SCA. Un mediador clave de la inflamación es el factor de transcripción nuclear NF-κB, el cual se activa en respuesta a estímulos inflamatorios e induce la expresión de genes inflamatorios como moléculas de adhesión y citoquinas proinflamatorias. La activación de NF-κB también regula la expresión de miRNA que a su vez pueden controlar la inflamación regulando esta vía de señalización. Además, los miRNA pueden regular postranscripcionalmente factores inflamatorios como citoquinas o moléculas de adhesión tanto de forma directa como indirecta. Para determinar si la expresión de miRNA circulantes relacionados con el SCA estaban asociados a los niveles de citoquinas pro y antiinflamatorias y de quimioquinas implicadas en la patología del SCA se realizó un análisis de correlación en todos los individuos del estudio. Como resultado, la expresión de todos los miRNA previamente relacionados con la manifestación aguda del SCA, excepto el miR-125a, mostraron una asociación con los niveles de citoquinas y quimioquinas implicadas en la patología del SCA. Los resultados obtenidos en la presente tesis destacan la importancia del tipo de muestra de partida al analizar la expresión de miRNA circulantes y se sugiere el suero como la muestra adecuada en pacientes con SCA, así como el miR-484 como control endógeno. Por primera vez se analiza el perfil de expresión de miRNA circulantes en pacientes con SCASEST en su manifestación aguda y después de un año de evolución clínica y se han identificado varios miRNA circulantes que podrían actuar como posibles biomarcadores de SCASEST. Entre ellos, dos de los componentes del cluster miR-99b/let-7e/miR-125a también se han visto implicados en la modulación de la función endotelial. Finalmente, la asociación existente entre la expresión de los miRNA relacionados con el SCASEST y los niveles séricos de citoquinas y quimioquinas implicadas en la patología del SCA, refuerza su posible uso como biomarcadores de SCASEST.
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