La cromatografía líquida de alta resolución (high performance liquid chromatography, HPLC) es actualmente la técnica de separación analítica más utilizada. Desafortunadamente, la eficacia suele ser menor que la obtenida en cromatografía de gases, electroforesis capilar y otras técnicas de electromigración. Esto limita el análisis de muestras complejas. De ahí el elevado esfuerzo dedicado a incrementar la eficacia y la selectividad en HPLC, con importantes mejoras desde el inicio de la técnica. A pesar de los avances en las últimas décadas, con el desarrollo de instrumentación cada vez más sofisticada (incluida la introducción de bombas de ultra-alta presión), y los avances en la tecnología de columnas (con la síntesis de nuevos soportes y fases estacionarias), aún existen desafíos por resolver. El trabajo realizado a lo largo de la Tesis Doctoral recoge algunas propuestas para mejorar el rendimiento de HPLC, que se presentan en dos grandes apartados: 1. Aumento de la capacidad de modelado en cromatografía líquida Las estrategias de optimización interpretativa se basan en la descripción exacta del comportamiento cromatográfico (retención y perfiles de pico), utilizando modelos matemáticos. La capacidad predictiva de los modelos ajustados dependerá de la calidad de la información proporcionada por el diseño experimental. Los experimentos isocráticos proporcionan la mayor calidad informativa, pero presentan el importante inconveniente de necesitar mucho tiempo para la adquisición de datos, y no son prácticos para solutos altamente hidrófobicos. Por esta razón, se recomienda el uso de diseños experimentales en gradiente. La Memoria de Tesis Doctoral recoge varios estudios que han profundizado en el análisis de los diseños experimentales para mejorar la capacidad de predicción de los modelos de retención, así como la propuesta de nuevos modelos para optimizar la resolución en presencia de aditivos. Se abordaron los siguientes objetivos: • Investigar la aplicación de las estrategias de optimización interpretativa en nano-cromatografía líquida utilizando columnas monolíticas poliméricas, y evaluar el comportamiento cromatográfico con diferentes fases estacionarias preparadas en el laboratorio. • Evaluar la capacidad predictiva de diversos diseños experimentales y modelos de retención, en base a la calidad de la información proporcionada por experimentos isocráticos, de gradiente y mixtos. • Analizar el potencial de experimentos isocráticos que incluyan incrementos transitorios de disolvente orgánico (pulsos) con propósitos de modelización. • Diseñar una nueva metodología para la estimación de la capacidad de pico, basada en la simulación fiable de picos cromatográficos, válida para una variedad de situaciones que incluye las contribuciones extra-columnares, la formación de picos asimétricos y el uso de gradientes multi-lineales. • Adaptar las estrategias de optimización interpretativa a cromatografía líquida micelar. Un interés particular es el desarrollo de nuevos modelos de retención que describen el comportamiento cromatográfico en dominios extendidos de disolvente orgánico, y la optimización de las condiciones de elución para el análisis de fluidos fisiológicos con elución isocrática y de gradiente. 2. Mejora del rendimiento de separación de huellas dactilares cromatográficas La resolución de muestras complejas que contienen compuestos desconocidos de diferente naturaleza, o de los que no se posee estándares, como es el caso de las huellas cromatográficas, sigue siendo un desafío. Por lo general, las muestras con huellas dactilares similares también tienen propiedades similares. Por tanto, este tipo de cromatograma tiene un interés potencial para determinar la identidad, autenticidad y consistencia entre lotes de productos naturales de diversa naturaleza. Aún se necesitan estrategias que permitan obtener huellas dactilares tan ricas en información como sea posible. Para ello, se deben desarrollar herramientas para procesar correctamente cromatogramas complejos y mejorar el rendimiento de la separación. Se abordaron los siguientes objetivos: • Avances en el pre-procesamiento de datos de huellas cromatográficas de productos naturales, con un particular interés en la sustracción de líneas base de muestras muy complejas, con poca supervisión. • Desarrollar una función objetivo cromatográfica válida para medir la calidad de la separación cuando no existen estándares disponibles. • Mejorar el análisis de productos naturales, obteniendo huellas dactilares cromatográficas informativas mediante cromatografía líquida bidimensional integral. El trabajo ha implicado un gran esfuerzo experimental, diseñado para explorar y extraer información sobre el comportamiento cromatográfico de familias de compuestos de diferente naturaleza. A lo largo de los estudios, se han utilizado una gran diversidad de condiciones experimentales utilizando fases móviles acuo-orgánicas con acetonitrilo y metanol, y fases móviles micelares puras e híbridas. El trabajo ha implicado un extenso tratamiento de datos, principalmente relacionados con la construcción de modelos para predecir la retención cromatográfica, forma de pico y resolución de mezclas de compuestos, con fines de optimización. También cabe destacar el gran esfuerzo en la realización de búsquedas bibliográficas sobre los diferentes temas investigados a lo largo del trabajo de Tesis Doctoral. Ello ha implicado la búsqueda, lectura y organización de una gran cantidad de información valiosa que se refleja adecuadamente en cada apartado de la Memoria.
2021-07-05
