Emerging fungi and mycotoxins in crops in the framework of climate change. Design of strategies for their prevention and control

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Publication date
2015
Reading date
25-05-2015
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Las micotoxinas son metabolitos secundarios fúngicos que se encuentran frecuentemente como contaminantes naturales en diversos alimentos habituales en la dieta humana y animal. Producen micotoxicosis agudas y crónicas que afectan principalmente al hígado, riñón y sistemas inmunológico y reproductor. Además, algunas de ellas como las aflatoxinas (AFLs) han sido reconocidas por la “International Agency for Research on Cancer” (IARC) como los compuestos naturales con mayor potencial teratogénico y cancerígeno para humanos que se conocen, a ellas le sigue la ocratoxina A (OTA), fumonisinas (FBs), deoxinivalenol (DON), zearalenona (ZEA), patulina (PAT) y citrinina (CIT). La IARC las ha clasificado en los grupos 1B, 2B, 2B, 3, 3, 3 y 3, respectivamente. Todas ellas están sometidas a legislación en los alimentos de mayor riesgo en la Unión Europea. Los hongos productores de micotoxinas son saprófitos o parásitos habituales en cosechas agrícolas en todo el mundo, especialmente, en las de cereales, frutas y frutos secos que se cultivan en regiones cálidas, más favorables para su desarrollo. Nuevos escenarios asociados al cambio climático regional y global están propiciando nuevos patrones de distribución fúngica y dominancia de las especies más competitivas bajo condiciones de estrés térmico e hídrico. Ello ha agudizado el problema de algunas micotoxinas producidas por esas especies en cosechas agrícolas. En este marco, se han planteado nuevos retos en seguridad y calidad alimentaria relacionados con hongos y micotoxinas emergentes en alimentos, que es necesario afrontar. Recientemente, las instituciones europeas competentes (EFSA, RASFF, CE) han alertado a la comunidad científica sobre la necesidad de nuevas investigaciones para conocer la identidad, incidencia, distribución, prevención y control sostenible de los hongos y micotoxinas más frecuentes en alimentos, considerando como tales las AFLs y la OTA. A ellas se han sumado los tricotecenos A (las toxinas T-2 y HT-2) debido a los altos niveles que se han registrado en cereales, en el centro y norte de Europa en los últimos años. Estudios predictivos relacionados con el cambio climático sitúan a España como zona de riesgo en materia de hongos y micotoxinas en cereales y uva. En el caso del viñedo y el vino, estudios recientes con metodologías avanzadas nos han permitido establecer que son Aspergillus carbonarius y la OTA, los peligros que es necesario controlar, y ello coincide con los países de nuestro entorno. Sin embargo, en cereales, a pesar de haber sido estudiados en el pasado, los conocimientos han quedado obsoletos por lo que la Comisión Europea demanda información actualizada a los países miembros. Conscientes del estado actual del tema, esta Tesis Doctoral se dirige al estudio de estos riesgos relacionados con hongos y micotoxinas emergentes en estos dos importante cultivos agrícolas españoles y al diseño de estrategias para su prevención y control sostenible. La investigación se recoge en tres capítulos. En el primer capítulo se aborda el estudio de la micobiota y micotoxinas contaminantes de la cebada española cultivada en las principales regiones productoras. Esta investigación se recoge en los artículos 1 y 2 de la Tesis. La investigación se inicia con un muestreo del cereal, representativo de las principales regiones productoras españolas, seguido de la detección, caracterización y cuantificación de las especies fúngicas en las muestras. Para ello se emplean técnicas clásicas basadas en la morfología macro- y microscópica del hongo, métodos cromatográficos aplicados al estudio de sus perfiles de producción de micotoxinas y protocolos muy recientes de PCR específicos de especie. Se realiza además por vez primera un estudio comparativo de ambos tipos de métodos, y un análisis crítico de las ventajas e inconvenientes para su aplicación en este campo. Esta investigación ha permitido identificar por vez primera especies que no habían sido descritas anteriormente en cebada como A. carbonarius y A. steynii productoras de OTA y se ha catalogado a A. flavus, productora de AFLB1 y AFLB2, como la especie micotoxigénica más frecuente en el cereal. Junto a ellas se han detectado otras de gran importancia en seguridad alimentaria como A. parasiticus, productora de AFLB1, AFLB2, AFLG1 y AFLG2, A. ochraceus y Aspergillus del agregado Niger, productoras de OTA, Fusarium verticillioides productora de FB1 y FB2, y F. graminearum y F. culmorum, productoras de ZEA, DON y nivalenol (NIV). Además de ello, se ha detectado por vez primera, en cebada española, la especie F. langsethiae, productora de las toxinas T-2 y HT-2. Esta especie es propia de cereales del centro y norte de Europa y hasta la fecha no había sido descrita en cereales españoles. Los resultados obtenidos muestran nuevos patrones de distribución de especies productoras de micotoxinas en cebada en España y por tanto, en Europa. Paralelamente al estudio micológico de la cebada, se aborda el estudio de todas las micotoxinas a las que se ha hecho referencia anteriormente en el cereal. Con este fin, se optimizan y aplican métodos para su extracción a alta presión, purificación mediante diferentes columnas de inmunoafinidad y de extracción en fase sólida, derivatización pre- o post-columna, cuando ello es posible, y análisis por LC o GC con diferentes sistemas de detección (fluorescencia, índice de refracción, ultravioleta, captura de electrones o espectrometría de masas). Este trabajo, además de aportar un importante avance metodológico ha permitido conocer que la micotoxina más frecuente en cebada española es la OTA seguida de DON, AFLB1, ZEA, FBs, NIV y las toxinas T-2 y HT-2. Aquí se describe por vez primera la presencia de AFLs en cebada, aunque a niveles que no superan los límites establecidos, y se proporciona información relevante requerida por la Comisión sobre incidencia de micotoxinas en cereales en España y por extensión, en Europa. La investigación recogida en esta primera fase de la Tesis se ha desarrollado en colaboración con científicos expertos del Departamento de Genética de la Universidad Complutense de Madrid en el ámbito de proyectos coordinados financiados por el Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO). En el segundo capítulo, se aborda el estudio de estrategias para la prevención y control sostenible del crecimiento de las más importantes especies productoras de OTA, AFLs y las toxinas T-2 y HT-2, en la cebada, y de la biosíntesis de las toxinas. La investigación se dirige en primer lugar a la especie ocratoxigénica más frecuente, A. carbonarius, bien conocida también como productora de OTA en viñedos, y a la especie A. ochraceus como la mayor productora de la toxina de la sección Circumdati. Se continua con A. flavus y F. langsethiae, especies productoras de AFLs y de las toxinas T-2+HT-2 respectivamente. La selección de los hongos para esta fase de la investigación se realiza en base a los resultados obtenidos en las muestras de cebada estudiadas en el capítulo primero de la Tesis, a anteriores estudios realizados en uva y a las prioridades de la Comisión Europea en materia de micotoxinas. La investigación que conforma este segundo capítulo de la Tesis, se recoge en los artículos 3, 4 y 5, y en trabajos muy recientes, pendientes de publicación que también se describen en detalle en este capítulo. En esta investigación se estudia la eficacia de antifúngicos usados en agricultura ecológica (azufre y oxicloruro de cobre) y convencional (mancozeb). Su efectividad frente a aislados de A. carbonarius y A. ochraceus fue aceptable, sin embargo, la mayor resistencia de A. flavus y F. langsethiae a estos compuestos hizo necesario al ensayo de otros antifúngicos más selectivos como azoles (procloraz, tebuconazol) y morfolinas (fempropimorf). En esta Tesis, se determinan por vez primera, y en diferentes condiciones ambientales, las dosis efectivas de todos los fungicidas usados que reducen el crecimiento de las especies citadas en un 50% (ED50) y en un 90% (ED90). Su efecto en el control de la producción de OTA, AFLB1, AFLB2, T-2 y HT-2 fue también significativo. Ello le convierte en el primer estudio que se realiza con estos antifúngicos, especies fúngicas y toxinas en diferentes condiciones de humedad y temperatura esperables a corto y medio plazo en el contexto del cambio climático. Los resultados obtenidos son de gran utilidad para el diseño de unas buenas prácticas agrícolas y de almacenamiento, y alertan sobre interacciones de factores bióticos (especie y cepa fúngica) y abióticos (factores ambientales, tipo y dosis de fungicida) que afectan a la eficacia de los tratamientos en el control del crecimiento fúngico y producción de micotoxinas. Se detectan y describen también situaciones de mediano estrés (hídrico, térmico y niveles bajos de fungicidas) en las diferentes especies estudiadas que lejos de controlar la producción de micotoxinas por el hongo, la potencian. La investigación aporta, además, resultados de fácil e inmediata transferencia al sector empresarial implicado en la fabricación y comercialización de antifúngicos, como las empresas Bayer CropScience S.A., Industrias Afrasa S.A. y Syngenta S.A. que han colaborado y suministrado todas las formulaciones empleadas. Buena parte de esta investigación se ha realizado en colaboración con científicos expertos en el tema de la Universidad de Cranfield, (Reino Unido), país con mayor índice de contaminación de cereales con las toxinas T-2 y HT-2, lo que refuerza su alcance internacional. Finalmente, el tercer capítulo se dirige al estudio y diseño de estrategias para la reducción de la OTA en medios líquidos, susceptibles de empleo en el procesado tecnológico de la cebada o la uva, para la fabricación de la cerveza o el vino. El objetivo de esta investigación fue la búsqueda de alternativas a otros posibles tratamientos, menos inocuos y más agresivos, como el uso de adsorbentes químicos, que pueden afectar a la calidad del producto final. Esta investigación se recoge en los artículos 6 y 7 de la Tesis. Para esta investigación se elige una especie bacteriana del ácido láctico, Oenococcus oeni, un procariota responsable de la fermentación maloláctica del vino que carece de efectos tóxicos para la salud. Se usan 10 aislados de O. oeni, todos ellos obtenidos de vino tinto. La investigación se inicia en medios favorables para el crecimiento de la bacteria suplementados con diferentes niveles de OTA (similares a los que presenta la cerveza o el vino de forma natural) que se inoculan con O. oeni en fase exponencial de crecimiento o bien células muertas inactivadas por calor. En estos cultivos se realiza un seguimiento de los niveles de la toxina en el medio mediante LC-FD. Las experiencias se completan con ensayos en medios suplementados con diferentes niveles de etanol más parecidos a una bebida alcohólica como el vino o la cerveza. Los resultados globales de ambos trabajos fueron excelentes ya que, en función de las condiciones del cultivo, los niveles de reducción de la OTA en el medio por O. oeni oscilaron entre 0,9 % y 63% y el proceso es independiente de la viabilidad de la bacteria por lo que O. oeni no actúa metabolizando la toxina. La reducción es mayor a mayor número de células en el medio y menor concentración de toxina. La reducción es menor en medios con elevada concentración de etanol y pH muy bajo. Ello concuerda con el hecho de que la eliminación de OTA se pueda producir debido a la adsorción de la toxina a uno o más componentes de la pared celular de O. oeni, probablemente a los ácidos teicoicos, y que el pH del medio influye en la adsorción o liberación de la toxina en el medio y, en consecuencia, en la efectividad del proceso. El uso de O. oeni como adsorbente de OTA en bebidas alcohólicas como el vino sería, por tanto, más eficaz en vinos en los que ocurre la fermentación maloláctica, ya que el ácido láctico es más débil que el málico y también se vería favorecido en cerveza y en vinos con menor concentración de etanol. Este es el primer trabajo que se realiza usando esta bacteria como posible herramienta para la reducción de la toxina en bebidas derivadas de materias primas contaminadas, abriendo así una importante línea de investigación en seguridad alimentaria. Nuevas investigaciones directamente en vino y cerveza, con cepas de O. oeni seleccionadas, serán objeto de futuros trabajos.
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