Funcional characterization pf p24d subfamily proteins in A.thaliana

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Publication date
2016
Reading date
16-12-2016
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Las proteínas p24 constituyen una familia de pequeñas (~24kDa) proteínas transmembrana de tipo-1 que localizan en los compartimentos de la vía secretora temprana, incluyendo las vesículas recubiertas de proteínas COP (Coat protein) I y COPII, implicadas en el transporte bidireccional entre el retículo endoplasmático (“endoplasmic reticulum”, ER) y el aparato de Golgi. En función de la homología de sus secuencias, las proteínas p24 pueden ser clasificadas en cuatro subfamilias: p24α, p24β, p24γ y p24δ. A diferencia de animales y levaduras, en plantas solo hay miembros de las subfamilias p24β y p24δ. En particular, Arabidopsis contiene 9 miembros de la subfamilia p24δ, los cuales se pueden dividir en dos subclases, δ-1 (p24δ3-p24δ6) y δ-2 (p24δ7-p24δ11), y 2 miembros de la subfamilia p24β. A partir de su transporte bidireccional entre el ER y el aparato de Golgi, se ha propuesto que las proteínas p24 funcionan como posibles receptores de cargo y que están implicadas en el control de calidad durante el transporte de proteínas en la vía secretora temprana, la organización de los sitios de salida del ER (“ER export sites”, ERES) y la biogénesis y mantenimiento del aparato de Golgi. El objetivo principal de la presente Tesis doctoral ha sido la caracterización funcional de las proteínas de la subfamilia p24δ en Arabidopsis. Para ello se han seguido dos aproximaciones diferentes. Por un lado se han obtenido los mutantes cuádruples nulos de ambas subclases, p24δ-1 (mutante p24δ3δ4δ5δ6) y p24δ-2 (mutante p24δ7δ8δ9δ10). Los mutantes p24δ3δ4δ5δ6 y p24δ7δ8δ9δ10 no mostraron alteraciones fenotípicas cuando fueron crecidos bajo condiciones estándar de crecimiento, lo que sugiere que las proteínas p24 de la subfamilia δ no son necesarias para el crecimiento bajo esas condiciones en Arabidopsis. El análisis de los niveles de proteínas en ambos cuádruples mutantes mostró una disminución en los niveles de otras proteínas p24, lo cual puede ser debido a una disminución de la estabilidad de dichas proteínas y no a una disminución de los niveles de mRNA, sugiriendo que esas proteínas p24 pueden funcionar formando complejos heteroméricos. Además, se investigó una posible alteración de los compartimentos de la vía secretora temprana. Se encontró que la pérdida de las proteínas p24δ-1 o p24δ-2 produce alteraciones principalmente en el aparato de Golgi. Esos datos sugieren que las proteínas p24 de la subfamilia δ están implicadas en el mantenimiento de la estructura y organización de los compartimentos de la vía secretora temprana en Arabidopsis. Además, se investigó el efecto de la pérdida de las proteínas p24δ en el transporte del receptor K/HDEL, ERD2, y de un ligando K/HDEL, la chaperona BiP. Se encontró que la pérdida de las proteínas p24 induce la acumulación del receptor ERD2a-YFP en el aparato de Golgi. Este efecto fue revertido mediante la co-expresión de p24δ5 (subclase δ-1) o de p24δ9 (subclase p24δ-2) o de un ligando K/HDEL. Además, la pérdida de proteínas p24δ induce la secreción de BiP, probablemente debido a una inhibición en el transporte retrógrado desde el aparto de Golgi hasta el ER de ERD2 mediado por vesículas COPI y, por tanto, en la recuperación de los ligandos K/HDEL. Finalmente se encontró que ambos mutantes cuádruples presentan una activación constitutiva de la respuesta a proteínas desplegadas (“unfolded protein response”, UPR), la cual puede actuar como mecanismo de compensación que ayuda a la planta a hacer frente a los defectos en el transporte en ausencia de las proteínas p24. De hecho, se observó un aumento de la asociación a membrana de varias subunidades COPI y COPII en ambos cuádruples mutantes. Además, la pérdida de proteínas p24δ-1 o p24δ-2 produjo un incremento en la expresión de SEC31, un gen implicado en la formación de vesículas COPII. Por otro lado, se investigó si las proteínas p24 de la subclase δ-1 en Arabidopsis se encuentran glicosiladas y si está glicosilación puede tener implicaciones funcionales, en particular respecto a su papel en la inclusión de ERD2 dentro de vesículas COPI para la recuperación de ligandos K/HDEL desde el aparato de Golgi hasta el retículo endoplasmático. Se encontró que un miembro de la subclase p24δ-1, p24δ5, es N-glicosilado en su domino GOLD, a diferencia de p24δ9, un miembro de la subclase p24δ-2. La N-glicosilación de p24δ5 no es necesaria para su localización en el ER en el estado estacionario, pero es importante para su interacción con el receptor K/HDEL, ERD2a, y para el transporte retrógrado de ERD2a y ligandos K/HDEL desde el aparato de Golgi hasta el ER.
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