Los trematodos (Platyhelminthes, Trematoda) son componentes ubicuos de los ecosistemas y, en las últimas décadas, los investigadores han mostrado un interés creciente en ellos, especialmente en sus estrategias y mecanismos de transmisión e infección. Los digeneos forman un grupo grande y generalmente tienen un ciclo de vida complejo con tres huéspedes. El primer huésped intermedio suele ser un molusco, el segundo huésped intermedio puede ser un huésped invertebrado o vertebrado, y el huésped definitivo suele ser un vertebrado. En el huésped definitivo, el parásito se convierte en adulto y se reproduce sexualmente. Luego, los huevos del parásito se liberan en el medio ambiente donde el miracidio, la primera etapa larvaria del ciclo de vida que nada libremente, infecta al primer huésped molusco intermedio. En el caracol, el miracidio luego se convierte en un esporoquiste o redia, en el que las cercarias se reproducen asexualmente. Numerosas cercarias maduras emergen del caracol al agua e infectan rápidamente al segundo huésped intermediario. Las cercarias penetran en el huésped y se enquistan como metacercarias, que experimentan morfogénesis para volverse infectivas para el huésped definitivo. En los últimos años, se ha sugerido que algunas metacercarias pueden alterar el comportamiento del huésped para aumentar la probabilidad de ser presa de un huésped definitivo adecuado. El estrigeido Cardiocephaloides longicollis (Rudolphi, 1819) Dubois, 1982 (Trematoda, Digenea) se encuentra ampliamente distribuido a lo largo de las costas europeas. Su ciclo de vida ha sido replicado en laboratorio, permitiendo tener una descripción completa de las diferentes etapas del ciclo de vida. Las cercarias de Cardiocephaloides longicollis se desarrollan en los esporocistos de caracoles nasariidos infectados (primer huésped intermedio) y cuando maduran, emergen al medio ambiente e infectan al segundo huésped intermedio, los peces, probablemente con la ayuda de receptores sensoriales. Sin embargo, queda por estudiar el patrón de penetración de las cercarias en los peces, así como los mecanismos durante su transmisión. Cardiocephaloides longicollis infecta principalmente a los peces espáridos y se enquista en su cerebro hasta que las metacercarias se vuelven infectivas y se transmiten tróficamente al huésped definitivo, principalmente a las laris que se alimentan de peces, en las que C. longicollis se convierte en un adulto y se reproduce sexualmente. Luego, los huevos del parásito se liberan en el agua, donde el miracidio infecta al caracol. Estudiar su estructura ofrece una mejor comprensión de sus adaptaciones, pero sus mecanismos y estrategias de transmisión aún no se comprenden bien, lo cual es fundamental dada su importancia en los ciclos de vida de los digeneos. Los pasos más importantes para la continuación del ciclo de vida son los eventos de transmisión entre hospedadores. Los trematodos han desarrollado estrategias y comportamientos adaptativos para facilitar el encuentro con el huésped y la infección. Por ejemplo, las adaptaciones y estrategias de las etapas de vida libre se asocian principalmente con respuestas a señales del medio ambiente y/o del huésped (quimioatracción) y con mecanismos que dependen principalmente de la morfología de las larvas. Los parásitos pueden deteriorar el estado físico del huésped y hacer que estén más expuestos a los depredadores. Por ejemplo, para llegar al huésped definitivo, algunos parásitos pueden afectar el comportamiento del segundo huésped intermedio para aumentar su probabilidad de ser depredados por el huésped definitivo. Pocos estudios han demostrado que este comportamiento no se deba a un efecto secundario patológico de la infección sino que sea provocado por el propio parásito. Por lo tanto, para probar la existencia de manipulación inducida por parásitos, los estudios teóricos deben combinarse con el trabajo empírico. Los modelos de laboratorio han demostrado ser útiles para apoyar los estudios parasitológicos, como el modelo de Toxoplasma gondii que infecta ratones. Sparus aurata L. es un pez importante en la acuicultura mediterránea y está naturalmente infectado con una variedad de parásitos, lo que lo convierte en un modelo ampliamente utilizado en estudios parasitológicos (por ejemplo, el monogéneo Sparicotyle chrysophrii y el nematodo Anisakis simplex). Dada la importancia del pescado utilizado en el trabajo experimental, es importante seguir la Guía para el Bienestar Animal y aplicar las 3R, que significan "Reemplazo", "Reducción" y "Refinamiento" para lograr resultados de alta calidad. Además, generalmente se requiere un sistema de marcado para diferenciar los peces individualmente. Sin embargo, el etiquetado de animales puede tener efectos secundarios y su éxito depende de muchos factores. Por lo tanto, al establecer una línea de investigación para especies de peces específicas, se recomiendan ensayos preliminares para seleccionar un sistema de marcado adecuado. En esta tesis se reprodujo en laboratorio parte del ciclo de vida del digeneo C. longicollis, lo que brindó la oportunidad de realizar ensayos experimentales. El objetivo principal de esta tesis fue comprender mejor las estrategias de transmisión de parásitos con ciclos de vida complejos, para estudiar en detalle el comportamiento de las cercarias desde su emergencia del caracol hasta la infección del cerebro de los peces, y optimizar los protocolos para el estudio de los efectos potenciales de las metacercarias enquistadas en el comportamiento de los peces. Las tinciones fluorescentes “in vivo” pueden ser útiles en el estudio de estadios larvales, como es el caso de las cercarias (estado larval en trematodos), pero su impacto debe probarse de antemano para garantizar resultados de alta calidad. Su uso permitió observar el patrón de penetración de C. longicollis cercariae en S. aurata en condiciones de laboratorio (Capítulo 4). Las cercarias se detectaron principalmente en áreas cercanas a la cabeza, la aleta dorsal y el lado ventral del pez, lo que indica una preferencia por portales de entrada específicos probablemente asociados con áreas cercanas al cerebro o con rutas de migración asociadas conectadas con él. La funcionalidad versátil de las estructuras corporales de las cercarias les permite mostrar diferentes comportamientos según su etapa de transmisión (Capítulo 5). En cada etapa de su transmisión, las cercarias utilizan sus estructuras de la manera más ventajosa, es decir, cuando se arrastran sobre la superficie del pez, las cercarias utilizan la ventosa oral y ventral, mientras que al cavar, realizan mayoritariamente movimientos peristálticos y utilizan las espinas superficiales y la ventosa oral para abrir el camino hacia el tejido de los peces. Se detectó a Cardiocephaloides longicollis migrando a través del tejido conectivo y las fibras musculares hacia el cerebro. Se descubrió que las marcas de elastómero de implante visible (VIE) son seguras y confiables para el arcaje a largo y corto plazo de una amplia gama de tamaños de dorada en condiciones de laboratorio (Capítulo 6). Se consideraron adecuados dos sitios de inyección, la aleta caudal y dorsal, sin embargo, la aleta caudal parece ser menos estable en peces en crecimiento. No se observó respuesta inmune severa, pero se detectó migración a tejidos distantes del compuesto principal de VIE, siendo esta la primera vez que se reporta en peces. Aunque no se detectaron efectos en la salud de los peces, es probable que la migración de VIE se reduzca limitando el volumen de silicona inyectada. Los resultados preliminares de los experimentos de comportamiento en peces infectados individualmente mostraron que C. longicollis enquistado en el cerebro de la dorada no parecía afectar la percepción del gradiente de luz, pero podría afectar la agudeza de sus respuestas y probablemente alterar otros comportamientos como escolarización y respuestas de escape (Capítulo 7). Por lo tanto, es necesario realizar más estudios. En conclusión, se ha demostrado que las cercarias de Cardiocephaloides longicollis tienen estrategias adaptativas para completar su ciclo de vida. El uso de C. longicollis como modelo en el laboratorio ha proporcionado una mejor comprensión de las estrategias de transmisión de parásitos con un ciclo de vida complejo. Se ha demostrado que la combinación de diferentes herramientas, como tinciones “in vivo” para facilitar la visualization de cercarias y el uso de marcas para identificar peces en ensayos experimentales, son necesarias para apoyar la investigación teórica.

Trematodes (Platyhelminthes, Trematoda) are ubiquitous components of ecosystems, and in recent decades, researchers have shown increasing interest in them, especially in their transmission and infection strategies and mechanisms. Digenean trematodes form a large group, and usually have a complex life cycle with three hosts. Digenean first intermediate host is usually a mollusc, the second intermediate host can be an invertebrate or vertebrate host, and the definitive host is typically a vertebrate. In the definitive host, the parasite develops into an adult and reproduces sexually. The eggs of the parasite are then released to the environment where the miracidium, the first free-swimming larval stage of the life cycle, infects the first intermediate molluscan host. In the snail the miracidium then develops into a sporocyst or redia, in which the cercariae reproduce asexually. Numerous mature cercariae emerge from the snail to the water and quickly infect the second intermediate host. The cercariae penetrate the host and encyst as metacercariae, which undergo morphogenesis to become infective to the definitive host. In recent years, it has been suggested that some metacercariae may alter the host behaviour to increase the likelihood of being preyed by a suitable definitive host. The strigeid Cardiocephaloides longicollis (Rudolphi, 1819) Dubois, 1982 (Trematoda, Digenea) is widely distributed along European coasts. Its life cycle has been replicated in the laboratory, allowing to have a complete description of the different stages of the life cycle. Cardiocephaloides longicollis cercariae develop in the sporocysts of infected nasariid snails (first intermediate host) and when mature, they emerge to the environment and infect the second intermediate host, fish, probably with help of sensory receptors. However, the cercariae penetration pattern into fish remains to be studied, as well as the mechanisms during their transmission. Cardiocephaloides longicollis infects primarily sparid fishes and encysts in their brain until the metacercariae become infective and are trophically transmitted to the definitive host, mainly fish-eating larids, in which C. longicollis develops into an adult and reproduces sexually. The parasite eggs are then released into the water, where the miracidium infects the snail. Studying their structure offers a better understanding of their adaptations, but their mechanisms and transmission strategies are not yet well understood, which is critical given their importance in digenean life cycles. The most important steps for the continuation of digenean life cycle are the transmission events from one host to the next. Trematodes have evolved adaptive strategies and behaviours to facilitate the host encounter and infection. For example, the adaptations and strategies of free-living stages are mostly associated with responses to cues from the environment and /or the host (chemo-attraction) and with mechanisms that rely mostly on larval morphology (e.g. furcocercariae exhibit a powerful and driven swim resulting from a well-developed bifurcated tail). Parasites can deteriorate the host fitness and make them longer exposed to predators. For example, to reach the definitive host, some parasites may affect the behaviour of the second intermediate host to increase their likelihood of being preyed by the definitive host. Few studies have demonstrated that this behaviour is not due to a pathological side effect of the infection but is caused by the parasite itself. Therefore, to prove the existence of parasite-induced manipulation, theoretical studies must be combined with empirical work. Laboratory models have proven useful to support parasitological studies, such as the model of Toxoplasma gondii infecting mice. Sparus aurata L. is an important fish in Mediterranean aquaculture, and is naturally infected with a variety of parasites, making it a widely used model in parasitological studies (e.g. the monogenean Sparicotyle chrysophrii and the nematode Anisakis simplex). Given the importance of fish used in experimental work, it is important to follow the Guide to Animal Welfare and apply the 3Rs, which stand for “Replacement”, “Reduction” and “Refinement” to achieve high quality results. In addition, a tagging system is usually required to differentiate fish individually. However, tagging animals can have side effects and its success relies on many factors. Therefore, when establishing a line of research for specific fish species, preliminary trials to select an appropriate tagging system is recommended. In this thesis, part of the life cycle of the digenean C. longicollis was reproduced in the laboratory, which provided the opportunity to conduct experimental assays. The main aim of this thesis was to better understand the transmission strategies of parasites with complex life cycles, to study in detail the behaviour of the cercariae after their emergence from the snail until the infection of the fish brain, and to optimize protocols for the study of potential effects of encysting metacercariae on fish behaviour. In vivo fluorescent dyes can be useful in the study of larval stages such as trematode cercariae, but their impact needs to be tested beforehand to guarantee high quality results. Their use allowed to observe the penetration pattern of C. longicollis cercariae into S. aurata under laboratory conditions (Chapter 4). Cercariae were detected primarily in areas near the head, the dorsal fin and ventral side of the fish, indicating a preference for specific entry portals likely associated with areas close to the brain or with associated migration routes connected with it. The versatile functionality of cercarial body structures allows them to display different behaviours according to their transmission stage (Chapter 5). In each stage of their transmission, cercariae use their structures in the most advantageous way, i.e. when crawling on the fish surface, the cercariae use the oral and ventral sucker, while when burrowing, they mostly perform peristaltic movements and use the surface spines and the oral sucker to open the path into the fish tissue. Cardiocephaloides longicollis was detected migrating through connective tissue and muscle fibres toward the brain. Visible Implant Elastomer tags (VIE) were found to be safe and reliable for long- and short-term tagging of a wide range of sizes of gilthead seabream under laboratory conditions (Chapter 6). Two injection sites were considered suitable; however, the caudal fin may be less reliable in long-term studies in growing fish. No severe immune response was observed, but migration to distant tissues of the main compound from VIE was detected, being this the first time, this has been reported in fish. Although no effects on fish health were detected, migration of VIE can likely be reduced by limiting the volume of silicone injected. Preliminary results of behavioural experiments on individually infected fish showed that C. longicollis encysted in the brain of gilthead seabream did not appear to affect the perception of the light gradient, but it could affect the acuity of their responses, and probably alter other behaviours such as schooling and escape responses (Chapter 7). Therefore, further studies need to be conducted. To conclude, Cardiocephaloides longicollis cercariae have been shown to have adaptive strategies to complete their life cycle. The use of C. longicollis as a model in the laboratory has provided a better understanding of the transmission strategies of parasites with a complex life cycle. The combination of different tools, such as in vivo dyes to label cercariae or tags to identify fish in experimental assays, have been shown to be necessary to gain empirical knowledge that supports theoretical research.