La estenosis traqueal es una situación de gran importancia clínica. Se calcula que se produce aproximadamente en el 5-20% de los pacientes intubados o traqueostomizados. La estenosis postintubación y los tumores traqueales son las indicaciones más frecuentes para la resección y reconstrucción de la tráquea. El tratamiento definitivo de la estenosis traqueal es la resección con anastomosis termino-terminal, sin embargo la tráquea no permite una resección mayor al 50% de su longitud y esto ha llevado a la experimentación con diferentes materiales protésicos e incluso el trasplante de vía aérea. Hasta la fecha, no existe una opción terapéutica exitosa para éste problema, una posible alternativa podría estar en la construcción de sustitutos traqueales mediante técnicas de Ingeniería Tisular. Las matrices traqueales descelularizadas deberían suponer la mejor opción para la generación de un sustituto traqueal ideal que sea biocompatible, no inmunogénico, con rigidez lateral y flexibilidad, hermético, epitelizable y vascularizable. El objetivo general de esta tesis consiste en la puesta a punto de un protocolo de descelularización de tráqueas porcinas efectivo para su posterior aplicación en tráqueas humanas. Para ello nos propusimos los siguientes objetivos concretos: 1. Ensayar diferentes detergentes incluyendo SDS, SDC y Tritón X-100 a diferentes concentraciones y combinaciones en un modelo de descelularización de tráquea porcina. Evaluaremos la eficacia de los mismos mediante el estudio histológico utilizando DAPI, hematoxilina eosina (H-E), tricrómico de Masson y orceína. 2. Optimizar las condiciones del detergente o combinación de detergentes que resulte más eficaz para la descelularización de la tráquea porcina, desde el punto de vista histomorfométrico, biomecánico y de biocompatibilidad de las matrices descelularizadas. 3. Determinar la biocompatibilidad in vitro de las tráqueas descelularizadas. 4. Poner a punto un protocolo de criogenización válido para generar un banco de tejidos descelularizados para su uso posterior. 5. Extrapolar los parámetros optimizados en el modelo porcino al modelo de tráquea humana. En base a los resultados obtenidos en este trabajo, podemos establecer las siguientes conclusiones: 1. El modelo porcino supone una buena alternativa a la tráquea humana a la hora de establecer un modelo de estudio de diferentes factores relevantes en el procedimiento de descelularización de las mismas, no solo por sus características anatómicas, compatibles con la humana, sino por sus características histológicas. Así, el estudio microscópico de los especímenes incluidos demuestra una organización tisular similar a la humana con mínimas diferencias que atienden sobre todo a una mayor organización de las fibras elásticas que forman parte del estroma de dicho órgano. 2. Todos los detergentes utilizados en el proceso de descelularización han demostrado una gran eficacia para la descelularización de las capas mucosa, submucosa y adventicia de las tráqueas estudiadas. Con respecto a la túnica cartilaginosa, únicamente el SDC y el SDS, han demostrado cierta eficacia a la hora de descelularizar dicha capa. El mayor rendimiento en lo referente a la eliminación de células de la capa cartilaginosa unido a un menor efecto lesivo sobre el contenido en colágeno de la matriz extracelular, convierte al SDS en el detergente más adecuado para la descelularización de tráquea porcina. 3. De las diferentes concentraciones de SDS testadas, la del 2% ha demostrado una mejor remoción de células del tejido y de ADN con mínimo impacto en la composición y organización de la matriz extracelular. La utilización de varios choques osmóticos con agua destilada consiguió disminuir la citotoxicidad del detergente y, por tanto, un menor efecto deletéreo sobre la supervivencia celular tanto en el cartílago como en la capa mucosa de las tráqueas. 4. Con respecto a la biocompatibilidad, las tráqueas descelularizadas con SDS al 2% permitieron la adhesión y proliferación de células epiteliales y la anidación de condrocitos en la capa cartilaginosa in vitro. 5. El protocolo de criopreservación propuesto en esta tesis no ha tenido efectos sobre la composición de la matriz extracelular en lo referente al contenido en fibras colágenas o elásticas. Todas las tráqueas criopreservadas demostraron una mejor respuesta biomecánica que las no preservadas, lo que podría deberse al aumento de la rigidez de las mismas como efecto de la congelación. 6. En lo referente a la extrapolación a la vía aérea humana, hemos observado una gran variación entre individuos. No obstante, en general, el efecto del protocolo de descelularización estandarizado en modelo porcino, no produjo grandes alteraciones en el contenido en fibras colágenas o elásticas, por lo que podría ser adecuado para descelularizar tráqueas humanas.

Tracheal stenosis is a situation of great clinical importance. It is estimated that it occurs in approximately 5-20% of intubated or tracheostomized patients. Post-intubation stenosis and tracheal tumors are the most frequent indications for resection and reconstruction of the trachea. The definitive treatment of tracheal stenosis is resection with end-to-end anastomosis, however the trachea does not allow a resection of more than 50% of its length and this has led to experimentation with different prosthetic materials and even airway transplantation. To date, there is no successful therapeutic option for this problem, a possible alternative could be the construction of tracheal substitutes using Tissue Engineering techniques. Decellularized tracheal matrices should be the best option for the generation of an ideal tracheal substitute that is biocompatible, non-immunogenic, with lateral rigidity and flexibility, hermetic, that can be epithelized and vascularized. The general objective of this thesis consists in the development of an effective decellularization protocol for porcine tracheas for its subsequent application in human tracheas. To this end, we set ourselves the following specific objectives: 1. Test different detergents including SDS, SDC and Triton X-100 at different concentrations and combinations in a porcine trachea decellularization model. We will evaluate their efficacy by histological study using DAPI, hematoxylin eosin (H-E), Masson's trichrome and orcein. 2. Optimize the conditions of the detergent or combination of detergents that is most effective for the decellularization of the porcine trachea, from the histomorphometric, biomechanical and biocompatibility point of view of the decellularized matrices. 3. To determine the in vitro biocompatibility of decellularized tracheas. 4. Set up a valid cryogenization protocol to generate a bank of decellularized tissues for later use. 5. Extrapolate the optimized parameters in the porcine model to the human trachea model. Based on the results obtained in this work, we can establish the following conclusions: 1. The porcine model is a good alternative to the human trachea when establishing a study model of different relevant factors in their decellularization procedure, not only because of its anatomical characteristics, compatible with the human one, but also because of its histological features. Thus, the microscopic study of the included specimens demonstrates a tissue organization similar to that of humans with minimal differences that are mainly due to a greater organization of the elastic fibers that form part of the stroma of said organ. 2. All the detergents used in the decellularization process have shown great efficacy for the decellularization of the mucosal, submucosal and adventitial layers of the tracheas studied. With regard to the cartilage layer, only SDC and SDS have shown some efficacy in decellularizing said layer. The higher performance regarding the elimination of cells from the cartilaginous layer together with a lower damaging effect on the collagen content of the extracellular matrix, makes SDS the most suitable detergent for the decellularization of porcine trachea. 3. Of the different concentrations of SDS tested, the 2% concentration has shown better removal of tissue cells and DNA with minimal impact on the composition and organization of the extracellular matrix. The use of several osmotic shocks with distilled water managed to reduce the cytotoxicity of the detergent and, therefore, a lesser deleterious effect on cell survival both in the cartilage and in the mucous layer of the trachea. 4. With regard to biocompatibility, 2% SDS decellularized tracheas allowed adhesion and proliferation of epithelial cells and nesting of chondrocytes in the cartilaginous layer in vitro. 5. The cryopreservation protocol proposed in this thesis has had no effect on the composition of the extracellular matrix in relation to the content of collagen or elastic fibers. All the cryopreserved tracheas showed a better biomechanical response than the non-preserved ones, which could be due to their increased rigidity as a result of freezing. 6. Regarding the extrapolation to the human airway, we have observed a great variation between individuals. However, in general, the effect of the standardized decellularization protocol in the porcine model did not produce major alterations in the content of collagen or elastic fibers, so it could be suitable for decellularizing human tracheas.