El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa de muerte por cáncer a nivel mundial, y es el tercero en incidencia. En los últimos años se han realizado grandes avances para entender mejor los aspectos clínico-patológicos y moleculares del CCR lo que ha conducido a una mejora de las terapias y aumentado la supervivencia de los pacientes. Sin embargo, pese a estos avances muchos pacientes no se benefician de los tratamientos, lo que evidencia la necesidad de búsqueda de nuevos biomarcadores de respuesta y modelos preclínicos adecuados que permitan avanzar hacia una medicina más personalizada. En este contexto, la tecnología de los organoides ha revolucionado el estudio in vitro del cáncer, y presenta un gran potencial de aplicabilidad a la práctica clínica, tanto como modelos para estudios a nivel molecular como posibles modelos predictivos de respuesta a fármacos. En este trabajo se describe la puesta a punto de un protocolo para el establecimiento de organoides tumorales (CTOs) y normales (CNOs) derivados de pacientes con cáncer colorrectal localizado, tratados en el Hospital Clínico Universitario de Valencia (HCUV) y la generación de un biobanco de estos modelos en el Instituto de Investigación Sanitaria INCLIVA. Tanto los organoides como el tejido del cual derivan, se han caracterizado a nivel morfológico y molecular observándose una elevada correlación entre ellos. A nivel genómico, se utilizó un panel de secuenciación NGS de diseño interno y se observó que los organoides exhibían las mismas mutaciones presentes en el tejido del cual derivaban. Del mismo modo, los organoides tumorales presentaban un perfil de número de copias genómico que coincidía con el perfil del tejido de origen. Por otro lado, fue importante observar que, al analizar los perfiles de expresión génica, mediante secuenciación de RNA, también existía una alta correlación cuando se comparaba el componente epitelial del tejido con los organoides derivados y además, este perfil de expresión se conservaba en los diferentes pases del cultivo. Todos estos análisis comparativos organoide/tejido a nivel molecular son un buen indicativo de hasta qué punto estas estructuras generadas están estrechamente relacionadas con el tumor de origen y permiten plantear estudios funcionales que ayuden a entender mejor el CCR. Varios estudios sugieren que la localización del tumor primario en el colon influye sobre las características clínico-patológicas de la enfermedad, separando en dos entidades distintas al CCR derecho y CCR izquierdo. Sin embargo, hasta el momento no se han utilizado los organoides para identificar biomarcadores que expliquen estas diferencias. En este trabajo se realizó un análisis de expresión diferencial entre organoides tumorales derechos versus izquierdos y se encontraron 632 genes diferencialmente expresados. También se realizó un estudio comparativo de expresión a nivel de miRNAs que llevó a la identificación de cinco miRNAs diferencialmente expresados en organoides derechos, todos ellos subexpresados en esta condición. Por otro lado, una de las ventajas que presentan los organoides es la facilidad de manipulación in vitro que podría permitir el cribado de fármacos en base al perfil molecular del paciente del cual derivan, ayudando a decidir el tratamiento más adecuado. En este trabajo, se ha puesto a punto un protocolo para evaluar la respuesta de los organoides al tratamiento con diferentes fármacos. En primera instancia, se realizó un ensayo de sensibilidad de los CTOs a quimioterápicos utilizados en el tratamiento del CCR y los organoides exhibieron distintos patrones de sensibilidad. La respuesta a quimioterápicos no se pudo relacionar con el estadio tumoral, sin embargo, si se observó que los organoides derivados de tumores localizados de estadio avanzado, localizados en el lado derecho del colon, exhibieron una menor sensibilidad al tratamiento con quimioterápicos. Estos resultados requieren una validación con mayor número de organoides. De forma paralela, se evaluó la respuesta de los CTOs a fármacos inhibidores de dianas específicas, en base a las alteraciones moleculares presentes en las diferentes líneas de organoides, y se observaron diferencias entre ellos, acorde a lo esperado y reportado en la literatura, lo que parece indicar que su comportamiento se asemeja a lo que realmente ocurre en los pacientes. Este trabajo ha contribuido a la generación de un procedimiento robusto y eficaz para la generación y caracterización de organoides tumorales procedentes de pacientes con CCR localizado con un gran potencial traslacional. En última instancia, se espera que este tipo de estudios puedan ayudar a comprender mejor esta enfermedad y conducir a tratamientos más personalizados en los pacientes con cáncer.