La Memoria de Tesis Doctoral incluye estudios fundamentales para incrementar el conocimiento en cromatografía líquida de microemulsiones (MELC, microemulsion liquid chromatography), un modo de fase inversa (RPLC, reversed-phase liquid chromatography), de desarrollo relativamente reciente, que utiliza una microemulsión como fase móvil. Las microemulsiones se forman mezclando agua, un disolvente apolar, un surfactante en forma de micelas y un co surfactante que estabiliza las micelas. Al incorporar el surfactante en la mezcla de agua y disolvente apolar, se forma una microestructura en la que éste penetra en la micela del surfactante, estabilizándose en su núcleo en forma de gotas diminutas. La formación de dichas gotas, rodeadas por la estructura de la micela, así como la adsorción de monómeros de surfactante sobre la fase estacionaria, produce mecanismos de retención y selectividades particulares, permitiendo además la solubilización de compuestos en un amplio intervalo de polaridades. Puesto que en MELC la cantidad de disolvente orgánico en la fase móvil es más baja y los tiempos de análisis más cortos, en comparación con la RPLC convencional, se considera una técnica más ecológica. A lo largo de los trabajos incluidos en la Tesis Doctoral, se mejoró el conocimiento sobre la composición adecuada de las microemulsiones como fases móviles en MELC, así como de los mecanismos de retención. Además, se modelizó el comportamiento cromatográfico, con el fin de ayudar al desarrollo de metodologías analíticas diversas en MELC, particularmente en el campo del análisis de productos farmacéuticos, fluidos fisiológicos y otros materiales biológicos. Las fases móviles se prepararon con el surfactante aniónico dodecilsulfato sódico (SDS), octano como disolvente apolar y 1 butanol como co-surfactante. También se exploró el uso de líquidos iónicos, en lugar de octano. Se realizaron estudios sobre las interacciones que tienen lugar dentro de la columna, en base al comportamiento de retención y perfiles de los picos cromatográficos (anchuras y asimetrías), utilizando como compuestos de prueba cuatro parabenos (ésteres de ácido 4 hidroxibenzoico), once antagonistas de los receptores β-adrenérgicos (compuestos básicos polares), y cinco antidepresivos tricíclicos (compuestos básicos apolares). La Memoria de Tesis Doctoral incluye: i. Un análisis detallado de toda la información necesaria para trabajar en MELC, que contiene el conocimiento acumulado hasta la fecha, constituyendo una guía útil para futuros investigadores. El número de artículos publicados en MELC es todavía limitado, pero diversos investigadores han ofrecido información valiosa. En cualquier caso, es evidente que este modo cromatográfico está recibiendo una atención creciente. Sin embargo, a pesar de la publicación de algunos artículos de revisión sobre MELC anteriores al inicio del trabajo de esta Tesis Doctoral, la información proporcionada era contradictoria y confusa, y requería un estudio profundo. ii. Un amplio estudio comparativo del análisis de compuestos básicos mediante MELC, respecto a la RPLC convencional, cromatografía líquida micelar (MLC, micellar liquid chromatography) y cromatografía líquida submicelar (HSLC, high submicellar liquid chromatography), las dos últimas técnicas también en presencia del surfactante SDS. Los compuestos básicos son de gran interés en farmacología, debido a que muchos principios activos poseen este carácter, cuyo control en los laboratorios analíticos se realiza principalmente mediante cromatografía líquida. El análisis de compuestos básicos mediante RPLC convencional ha constituido un desafío desde el inicio de la cromatografía líquida, ya que en el intervalo de pH habitual para la fase móvil (por debajo de 7), los compuestos básicos forman especies protonadas catiónicas, que interaccionan con los silanoles aniónicos residuales que existen en las fases estacionarias de base sílice (las más habituales en la práctica experimental). Dicha interacción da lugar a un rendimiento deficiente (solutos demasiado retenidos y picos anchos que muestran colas). La Memoria de Tesis Doctoral demuestra que la MELC mejora el análisis de los compuestos básicos, tanto polares como apolares. iii. El primer estudio sobre la modelización del comportamiento de retención en MELC, en función de la composición de la fase móvil, en el que se considera el efecto simultáneo de los tres factores implicados en el comportamiento cromatográfico (surfactante, disolvente apolar y co-surfactante). La propuesta de una ecuación matemática exacta, para modelizar la retención, tiene interés en el desarrollo de un método interpretativo para obtener las condiciones óptimas de separación. Por otro lado, el estudio realizado arrojó información útil sobre los mecanismos de retención en presencia de una microemulsión. iv. La propuesta y validación exhaustiva, de acuerdo a las directrices de la ICH (International Conference of Harmonization), de un procedimiento de MELC para analizar antidepresivos tricíclicos en preparados farmacéuticos comercializados en España. El procedimiento se comparó con otros procedimientos previamente propuestos que utilizan RPLC convencional con mezclas de acetonitrilo-agua (lo que supone tiempos de análisis prolongados, picos deformados y un elevado consumo de disolvente orgánico), MLC con fases móviles que contienen SDS y 1-pentanol, y MLC con disoluciones acuosas de Brij-35 sin disolvente orgánico. La validación incluyó el estudio de la linealidad de las curvas de calibrado, la determinación de la precisión y exactitud intra- e interdiaria, y la estimación de los límites de detección y cuantificación, así como la verificación de la robustez. v. A fin de incrementar el carácter verde de los procedimientos analíticos, la posibilidad de emplear líquidos iónicos de 1-alquil-3-imidazolio con cadenas alquílicas que contienen de 2 a 6 carbonos, junto a los aniones cloruro, tetrafluoroborato y hexafluorofosfato, para el análisis de compuestos básicos mediante MELC, en lugar de disolventes apolares. El comportamiento se interpretó en comparación con el observado con fases móviles que contienen líquidos iónicos sin SDS y acetonitrilo en lugar de 1 butanol. Dado que en las fases móviles con SDS y líquido iónico, el papel del 1 butanol es menos importante para la obtención de mezclas transparentes y retenciones adecuadas, se comprobó la posibilidad de utilizar una fase móvil preparada con tan sólo SDS y cloruro de 1-hexil-3-metilimidazolio. Se constató que la combinación de SDS y líquido iónico da lugar a un procedimiento de RPLC verde para la separación satisfactoria del grupo de receptores β adrenérgicos analizado, sin la necesidad de añadir un disolvente orgánico.

The work in this PhD. Project includes fundamental studies to increase the knowledge in microemulsion liquid chromatography (MELC), a relatively new reversed-phase (RPLC) mode that utilises a microemulsion as mobile phase. Microemulsions are formed by mixing water, non-polar solvent, a surfactant forming micelles and a co-surfactant to stabilise the micelle. By incorporating the surfactant into the water / non-polar solvent mixture, a micro-structure is formed, where the non-polar solvent penetrates the surfactant micelle, being stabilised at its core in the form of tiny droplets. The formation of the droplets, surrounded by the micelle structure, and the adsorption of monomers of surfactant on the stationary phase, gives rise to particular retention mechanisms and selectivities, and allows the solubilisation of compounds in a wide range of polarities. Since in MELC the amount of organic solvent is smaller and the analysis times shorter, compared to conventional RPLC techniques, it is considered as a greener technique. Throughout the PhD. work, knowledge about the proper composition of microemulsions as mobile phases in MELC, as well as the retention mechanisms, was improved. In addition, the chromatographic behaviour was modelled, in order to help the development of diverse analytical methodologies in MELC, particularly in the field of the analysis of pharmaceutical products, physiological fluids and other biological materials. The mobile phases were prepared with the anionic surfactant sodium dodecyl sulphate (SDS), octane as non-polar solvent, and 1 butanol as co surfactant. The use of ionic liquids was also explored, instead of octane. Studies on the interactions that take place inside the column, based on the retention behaviour and profiles of chromatographic peaks (widths and asymmetries), were carried out using as probe compounds four parabens (esters of 4 hydroxybenzoic acid), eleven β adrenoceptor antagonists (polar basic compounds), and five tricyclic antidepressants (non-polar basic compounds). The PhD. Project includes: i. A detailed analysis of all needed information to work in MELC, which gathers all knowledge up-to-date, and may offer a useful guide for future researchers. The number of published reports in MELC is still limited, but several researchers offer valuable information. In any case, it is evident that this chromatographic mode is receiving growing attention. However, despite the publication of some review articles on MELC in previous years, the given information was found contradictory and confusing, and needed a deep study. ii. An extensive comparison study of the analysis of basic compounds by MELC, with regard to conventional RPLC, micellar liquid chromatography (MLC) and high submicellar liquid chromatography (HSLC), the two latter surfactant-mediated techniques employing SDS. Basic compounds are of great interest in pharmacology, because many active principles have this character, whose laboratory control is carried out mainly by liquid chromatography. The analysis of basic compounds using conventional RPLC has been a challenge since the beginning of liquid chromatography, since in the usual mobile phase pH range (below 7), basic compounds form cationic protonated species, which interact with residual anionic silanols on silica-based stationary phases, which are the most usual in the experimental practice. This produces poor performance (increased retention and formation of broad and tailed peaks). The PhD. Project demonstrates that MELC improves the analysis of both polar and non polar basic compounds. iii. The first study on the modelling of the retention behaviour in MELC, as a function of the composition of the mobile phase, where the simultaneous effect of the three factors involved in the chromatographic behaviour (surfactant, non-polar solvent and co surfactant) was considered. The proposal of an accurate mathematical equation to model the retention is interesting to develop an interpretive method to obtain the optimal separation conditions. The development of the retention model also gave some light on the retention mechanism, in the presence of a microemulsion. iv. The proposal and exhaustive validation, according to the International Conference of Harmonization guidelines, of an MELC procedure to analyse tricyclic antidepressants in pharmaceutical preparations commercialised in Spain. The procedure was compared with other procedures previously reported using conventional RPLC with acetonitrile-water mixtures (which implies long analysis times, deformed peaks and high consumption of organic solvent), MLC with mobile phases containing SDS and 1 pentanol, and MLC with aqueous solutions of Brij-35 without organic solvent. The validation involved the study of the linearity of calibration curves, the determination of intra and inter-day precision and accuracy, and the estimation of limits of detection and quantification, as well as the verification of robustness. v. With the purpose of increasing the green character of the analytical procedures, the possibility of using 1-alkyl-3-imidazolium ionic liquids with alkyl chains containing 2 to 6 carbons, together with the chloride, tetrafluoroborate, and hexafluorophosphate anions, for the MELC analysis of basic compounds, instead of a non polar solvent. The observed behaviour was interpreted in comparison with mobile phases containing ionic liquids without SDS, and acetonitrile instead of 1 butanol. Since in the mobile phases with SDS and ionic liquid, the role of 1-butanol was less important to get clear mixtures and adequeate retention, the use of a mobile phase prepared with only SDS and 1 hexyl-3-methylimidazolium chloride was checked, which yielded a satisfactory green RPLC procedure for the separation of the group of β adrenoceptor antagonists, without the need of organic solvent.