Las bebidas a base de zumo de frutas y leche son matrices adecuadas para el enriquecimiento con esteroles vegetales (EV) debido a su perfil nutricional saludable y aporte de compuestos antioxidantes (β-criptoxantina (β-Cx), polifenoles y vitamina C). Aunque el efecto más estudiado de los EV es el hipocolesterolemiante, recientes estudios apuntan a que podrían tener beneficios adicionales sobre la defensa frente a estrés oxidativo, procesos inflamatorios a nivel intestinal y sistémico y actividad antiproliferativa en células de cáncer de colon. El enriquecimiento con galactooligosacáridos (GOS) podría ser una estrategia para mejorar la funcionalidad de las bebidas enriquecidas en EV, dado su conocido efecto beneficioso sobre la microbiota intestinal y procesos inflamatorios colónicos, si bien se ha indicado que la adición de fibra soluble puede reducir la bioaccesibilidad de los esteroles en modelos de digestión gastrointestinal simulada. El objetivo general de la Tesis Doctoral es evaluar la influencia que ejercen los GOS sobre la bioaccesibilidad de los esteroles y los efectos beneficiosos asociados al consumo regular de bebidas a base de zumo de frutas y leche conteniendo EV, β-Cx y GOS con un abordaje triple: in vitro (Caco- 2), ex vivo (eritrocitos humanos) e in vivo (Caenorhabditis elegans y ratones). La adición de GOS a bebidas enriquecidas con EV (2,5 g/250 ml) (MfB) a dosis de 2,3 y 4,5 g/250 ml (MfB-G2 y MfB-G5, respectivamente) no afecta a la bioaccesibilidad del colesterol (78-88%) y EV totales (~37%) evaluada tras la aplicación de una digestión gastrointestinal micelar, por lo que se selecciona la bebida con mayor contenido de GOS para posteriores estudios de bioactividad (MfBG5). La aplicación del método estandarizado de digestión Infogest a la bebida sin GOS no permite la cuantificación del colesterol en la fracción bioaccesible y requiere un cambio en el origen de las sales biliares utilizadas (bovinas en lugar de porcinas) o reducir la concentración de sales biliares de origen porcino (10 mM a 1,4 mM). Los resultados obtenidos en los ensayos de citoprotección en células Caco-2 diferenciadas (modelo de epitelio intestinal) indican que la pre y coincubación con las fracciones bioaccesibles de las bebidas objeto de estudio protegen frente al estrés oxidativo y la apoptosis inducida por óxidos del colesterol (COPs). El efecto citoprotector observado se confirma en el modelo de C. elegans en el que las bebidas, además de reducir el estrés oxidativo producido por los COPs y el H2O2, incrementan la longevidad del nematodo. En general, la bebida con GOS no potencia el efecto citoprotector. En células Caco-2 diferenciadas y en modelo murino con colitis crónica, se constata que la presencia de GOS reduce el efecto beneficioso de las bebidas sobre mediadores proinflamatorios (IL-6, IL-8 y factor nuclear-κB (NF-κB)), los síntomas clínicos asociados a la colitis y el daño del tejido colónico. 4 Los EV de forma individual o como mezcla, a concentraciones colónicas, muestran un efecto antiproliferativo en células Caco-2 no diferenciadas, siendo más efectivos cuando se incuba como mezcla de EV. Así mismo, se observa que los EV a concentraciones séricas, estimadas a partir de la ingesta de una bebida enriquecida en EV y β-Cx, atenúan la activación de procesos eriptóticos y previenen completamente la hemólisis en eritrocitos humanos inducida por la β-Cx con y sin estrés oxidativo. Por lo tanto, los resultados obtenidos a partir de los diferentes modelos utilizados indican que la adición de GOS a las bebidas a base de zumo de fruta y leche enriquecidas en EV no modifican la bioaccesibilidad de los EV. Además, no mejoran los efectos biológicos relativos a citoprotección e inflamación in vitro e in vivo.

Milk-based fruit beverages are suitable matrices for enrichment with plant sterols (PS) due to their healthy nutritional profile and presence of antioxidant compounds (β-cryptoxanthin (β-Cx), polyphenols and vitamin C). Although the cholesterol-lowering effect of PS is the most studied, recent studies suggest that PS could have additional benefits on defence against oxidative stress, inflammatory processes at intestinal and systemic levels and anti-proliferative activity in colon cancer cells. The enrichment with galactooligosaccharides (GOS) could be a strategy to improve the functionality of PS-enriched beverages, given its known beneficial effect on the intestinal microbiota and colonic inflammatory processes. However, it has been indicated that the addition of soluble fibre can reduce bioaccessibility of sterols in simulated gastrointestinal digestion models. The aim of the Doctoral Thesis is to evaluate the influence of GOS on the bioaccessibility of sterols and the beneficial effects associated with regular consumption of milk-based fruit beverages containing PS, β-Cx and GOS with triple approach; in vitro (Caco-2), ex vivo (human erythrocytes) and in vivo (Caenorhabditis elegans and mice). The addition of GOS to PS-enriched beverages (2.5 g / 250 ml) (MfB) at doses of 2.3 and 4.5 g/250 ml (MfB-G2 and MfB-G5, respectively) does not affect the evaluated bioaccessibility of cholesterol (78-88%) and total PS (~ 37%) after micellar gastrointestinal digestion. Therefore, the beverage with the highest GOS content is selected for subsequent bioactivity studies (MfB-G5). The application of the standardised digestion method of Infogest to the beverage without GOS does not allow the quantification of cholesterol in the bioaccessible fraction and requires a change in the origin of the bile salts used (bovine instead of porcine) or a reduction in the concentration of porcine bile salts (10 mM to 1.4 mM). The results obtained from the cytoprotective assays in differentiated Caco-2 cells (intestinal epithelial model) indicate that pre- and co-incubation with the bioaccessible fractions of the beverages tested protects against oxidative stress and apoptosis induced by cholesterol oxidation products (COPs). The cytoprotective effect observed is confirmed in the C. elegans model in which beverages, in addition to reducing the oxidative stress produced by COPs and H2O2, increase the longevity of the nematode. In general, the beverage with GOS does not enhance the cytoprotective effect. In differentiated Caco-2 cells and in the murine model with chronic colitis, the presence of GOS reduces the beneficial effect of beverages on pro-inflammatory mediators (IL-6, IL-8 and nuclear factor-κB (NF-κB)), as well as the clinical symptoms associated with colitis and colonic tissue damage. Individual or mixed PS, at colonic concentrations, show an anti-proliferative effect on undifferentiated Caco-2 cells, being more effective when incubated as a PS mixture. Likewise, PS at 6 serum concentrations, estimated from the intake of a beverage enriched in PS and β-Cx, attenuate the activation of eryptotic processes and completely prevent haemolysis in human erythrocytes induced by β-Cx with and without oxidative stress. Therefore, the results obtained from the different models indicate that the addition of GOS to PSenriched milk-based fruit beverages does not modify the bioaccessibility of PS. In addition, they do not improve the biological effects related to cytoprotection and inflammation in vitro and in vivo.