Reciprocal communication between the endometrium and the preimplantation embryo is required for pregnancy. Our previous work described a novel cell-to-cell communication mechanism involving the delivery of endometrial microRNAs from the maternal endometrium to the trophectoderm cells of preimplantation embryos. More specifically, in vitro transfer of hsa-miR-30d supported mouse embryo adhesion by increasing expression of the adhesion molecules Cdh5, Itβ3, Itα5 in trophectoderm cells. The present doctoral thesis uses a miR-30d KO model to give answer two well-defined objectives: determine the mechanism by which miR-30d is incorporated into the maternal-derived extracellular vesicles and to investigate the impact of maternal or embryonic-origin miR-30d deficiency on implantation and subsequent fetal development. Regarding the first objective, mass spectrometry carried out after performing a co-immunoprecipitation with a biotinylated miR-30d in lysates from human endometrial epithelial cells (hEECs) and their derived exosomes allowed us to identify several proteins that could exert this role within cells. Among them, we found hnRNPC1, a ribonucleoprotein traditionally involved in directing the transfer of mRNAs from the nucleus to the cytoplasm. Co-localization studies of hnRNPC1 with the exosome marker CD63 and FACS analyses demonstrated the presence of hnRNPC1 inside exosomes. Silencing of hnRNPC1 in an Ishikawa endometrial adenocarcinoma cell line resulted in a sharp decrease of the levels of miR-30d in both epithelial-like cells and exosomes, suggesting its pivotal role in miR-30d biogenesis and transfer. Co-culture assays of miR-30d knock out (KO) embryos with sihnRNPC1 hEECs revealed a decrease in embryo-miR-30d acquisition in the adhesion and invasion stages. The lower adhesion levels observed are evidence that hnRNPC1 is an important player in the maternal-fetal communication established in the early stages of implantation. On the other hand, the endometrial receptivity markers COX2, LIF, MSX1, MSX2, ESR, and PGR were used to examine the impact of miR-30d deficiency, being LIF significantly downregulated in the endometrium of KO mothers. Next, different maternal-embryonic crosstalk scenarios were tested by controlling the origin of miR-30d or its deficiency by transferring WT, miR-30d KO, or KO embryos pre-treated with miR-30d into WT or KO recipients. When transferred into WT recipients, KO embryos had poorer implantation rates (IR) than WT embryos (p = 0.0061). Even lower implantation rates were seen when comparing KO and WT embryos transferred into KO dams (p = 0.0059). Interestingly, a positive correlation (r = 0.9978) was observed for maternal LIF expression and the IR, suggesting dysregulation of LIF associated with the miR-30d knockdown. Also, the course of gestation appeared compromised in KO females as evidenced by smaller implantation sites, higher rates of resorption, and fetuses with smaller crown rump-lengths and FW:PW ratios.Introducción En el proceso de implantación embrionaria se produce una relación sincrónica entre el endometrio y el embrión que resulta fundamental para su correcta consecución; dicha sincronía se mantiene durante la gestación gracias a la existencia de una comunicación bidireccional entre la madre y el feto basada en la secreción de señales específicas que permiten regular un desarrollo cooperativo. Efectivamente, se ha observado como el embrión libera moléculas específicas del estado gestacional (ej.: gonadotropina coriónica humana o interferón tau en rumiantes), para prevenir la luteólisis inducida por la prostaglandina F2alpha, posibilitando la secreción continua de progesterona durante la gestación. Del mismo modo, las secreciones uterinas regulan el estado de desarrollo embrionario y promueven la proliferación del trofectodermo, la migración, o la unión al epitelio luminal endometrial. Debido a la relevancia de este proceso de comunicación entre la madre y el embrión, el estudio del microambiente en el que se produce dicha comunicación bidireccional ha suscitado un gran interés recientemente. Entre las publicaciones más destacadas en este campo, se encuentran aquellas que se focalizan en el papel que ejerce el líquido endometrial (LE), tanto en el proceso de implantación como en el desarrollo embrionario posterior. El LE está constituido principalmente por el trasudado plasmático y las secreciones del epitelio luminal y glandular, que aportan toda una batería de compuestos como aminoácidos, iones, carbohidratos, lípidos y proteínas (incluyendo citoquinas, enzimas, hormonas, factores de crecimiento, transportadores, proteasas y factores inmunomoduladores) encargados de suministrar una nutrición temprana al conceptus (embrión junto con sus membranas asociadas) durante el periodo previo a la formación de las estructuras placentarias. La presencia de microARNs (miARNs) en el LE ha suscitado gran interés debido a su función en la regulación de la expresión génica. Los miARNs son moléculas de ARN no codificante de aproximadamente 22-25 nt de longitud capaces de regular hasta cientos de ARN mensajeros (mRNA) diana mediante complementación perfecta o imperfecta con las regiones 3’ no traducidas (UTR) de sus transcritos diana. Normalmente participan en procesos de degradación o inhibición de la traducción, aunque también se han descrito casos de miARNs capaces de inducir expresión proteica (Mehta y Baltimore, 2016). Los miARNs regulan la expresión génica en tejidos fetales y maternos a lo largo de todo el curso gestacional. Inicialmente, se describió la existencia de patrones de expresión diferencial de miARNs en células epiteliales endometriales a lo largo del ciclo menstrual, sugiriendo que su presencia podría estar sujeta a regulación hormonal en el endometrio humano (Kuokannen et al., 2010). Más tarde, se identificó un perfil específico de miARNs en pacientes con fallo recurrente de implantación que inhibían a genes implicados en rutas de señalización cruciales para la implantación embrionaria (ej.: vía de uniones adherentes, señalización WNT, ruta p53, ciclo celular, adhesión celular o cáncer) (Revel et al., 2011). Asimismo, se ha podido identificar un perfil diferencial entre la ventana de implantación y estadios pre-receptivos, tanto en ciclos naturales como estimulados, lo cual se podría emplear como potencial biomarcador de receptividad endometrial (Sha et al., 2011; Altmäe et al., 2012). Actualmente, los miARNs se consideran uno de los mejores reguladores de comunicación celular, ya que pueden transferirse intercelularmente desempeñando papeles fundamentales en múltiples procesos celulares. Su estructura y tamaño, así como sus mecanismos de transporte asociados, les confieren una gran estabilidad en múltiples fluidos biológicos (Larrea et al., 216; Turchinovich et al., 2013), pudiendo persistir de esta forma a condiciones adversas como: bajos niveles de pH, elevadas temperaturas o procesos de congelación (Pieters et al., 2015). Los miARNs extracelulares pueden transportarse asociados a proteínas como Argonauta 2, nucleophosmina 1 o lipoproteínas. Sin embargo, uno de los métodos de transporte más importante es el mediado por vesículas extracelulares (cuerpos apoptóticos, microvesículas y/o exosomas) ya que protegen a los miARNs de la degradación y contribuyen a su vez a incrementar su estabilidad dentro de los fluidos biológicos. Nuestro grupo de investigación ha descrito un mecanismo de comunicación materno-embrionario donde los miARNs de origen materno eran internalizados por el trofoectodermo de embriones murinos, bien de forma libre o en el interior de vesículas (Vilella et al., 2015). Concretamente, este trabajo mostró que la transferencia del miARN miR-30d favorecía la sobreexpresión de moléculas implicadas en procesos de adhesión celular (ITα7, ITβ3 y CDH5) en células del trofoectodermo. Asimismo, se demostró que el pretratamiento de embriones murinos con un análogo del miR-30d incrementaba significativamente las tasas de adhesión embrionaria, sugiriendo que los miARNs extracelulares podrían actuar como modificadores transcriptómicos de embriones pre-implantatorios. De forma análoga, se ha descrito que las células epiteliales endometriales liberan exosomas en el interior de la cavidad uterina a lo largo de las diferentes fases del ciclo menstrual, siendo la firma de miARNs en el interior de vesículas claramente distinta a la identificada en las células epiteliales endometriales de origen. Dicha firma diferencial tiene como dianas genes que participan de forma activa en diversas rutas relacionadas con la implantación (ej. uniones adherentes, interacciones receptor-matriz extracelular, factor de crecimiento endotelial vascular, JAK-STAT o receptores tipo Toll) (Ng et al., 2013). Actualmente, los miARNs están adquiriendo relevancia como potenciales biomarcadores de enfermedades, perfilándose de esta manera como nuevas herramientas de cribado genético no invasivo (Barcgitta et al., 2017). De hecho, ya existen indicios de la existencia de una estrecha relación entre perfiles anómalos de miARNs y complicaciones gestaciones tales como el fallo de implantación (Revel et al., 2011, Sha et al., 2011), preeclampsia (Choi et al., 2013, Li et al., 2013, Munaut et al., 2016), parto prematuro (Elovitz et al., 2014, Elovitz et al., 2015, Sanders et al., 2015) o restricción del crecimiento intrauterino (Song et al., 2013, Hromadnikova et al., 2017, Hu et al., 2014). Hipótesis La hipótesis del presente trabajo es que la comunicación bidireccional establecida entre el endometrio materno y el embrión a través del miR-30d afecta tanto a la implantación del embrión, así como el desarrollo fetal posterior dependiendo de si su origen es materno o embrionario. Objetivos Determinar el mecanismo de incorporación del miR-30d al interior de las vesículas extracelulares secretadas por el endometrio materno. Investigar el impacto de la deficiencia del miR-30d de origen materno o embrionario sobre la implantación embrionaria y el desarrollo fetal. Metodología Inicialmente, se realizó un cribado preliminar de aquellas proteínas que podían dirigir el transporte de miR-30d al interior de la cavidad exosomal mediante espectrometría de masas utilizando extractos de células epiteliales endometriales (hEECs), así como exosomas derivados de las mismas. Del conjunto de las proteínas identificadas, se seleccionaron aquellas que estaban relacionadas con el transporte de ARN en el interior celular. Posteriormente, para discernir si dichas proteínas se localizaban en el interior de exosomas y no adheridas a la superficie de estos, se realizaron ensayos de western blot (WB), estudios de co-localización con el marcador exosomal CD63 y citometría de flujo con exosomas previamente acoplados a bolas aldehído sulfato. La validación de la interacción proteína-ARNm se efectuó mediante una inmunoprecipitación con extractos de células Ishikawa y exosomas obtenidos a partir de las mismas. Finalmente, con el fin de determinar la relevancia funcional de la proteína identificada en los primeros estadios de la implantación se llevó a cabo su silenciamiento mediante mecanismos de silenciamiento mediados por ARNs pequeños de interferencia (ARNspi). En este sentido, se realizaron ensayos de adhesión embrionaria con embriones procedentes de una cepa knock out (KO) para el miR-30d sobre células Ishikawa doblemente transfectadas con ARNspi y sondas molecular beacon (MB) diseñadas específicamente para el reconocimiento del miR-30d en células vivas. Tras confirmar en un modelo heterólogo in vitro que el bloqueo del transporte del miR-30d ocasionaba un fenotipo de implantación deficiente, se realizaron ensayos in vivo en los que se estudiaron los marcadores de receptividad endometrial. Con este fin, se generaron ratonas pseudogestantes en las que en día 4 y 5 se analizó la expresión de Cox2, Lif, Msx1, Msx2, Esr y Pgr mediante PCR cuantitativa, ensayos de inmunofluorescencia y WB. A continuación, se evaluó el impacto del bloqueo de la transferencia bidireccional del miR-30d en el fenotipo de implantación en distintos contextos de comunicación materno-fetal. Para ello, se realizaron transferencias de embriones wild type (WT), KO y KO pretratados con un análogo del miR30d en úteros de ratonas pseudogestantes WT y KO, registrándose tanto la expresión de los marcadores de receptividad, como las tasas de implantación embrionaria alcanzadas. Finalmente, se evaluaron ciertos parámetros de desarrollo fetal y placentario tanto en el genotipo WT como el KO, realizándose en última instancia análisis morfológico de las crías de ambos genotipos, una vez destetadas. Resultados y discusión Las vesículas secretadas por el endometrio materno participan en la comunicación materno-fetal en las primeras etapas del proceso de implantación. En este contexto, nuestro grupo de investigación observó que la transferencia del miR-30d a través de exosomas favorecía la implantación embrionaria regulando la expresión de moléculas de adhesión en células del trofectodermo. Sin embargo, se desconocía el mecanismo por el cual, el miARN se incorporaba al interior de exosomas y el efecto que este producía una vez internalizado in vivo. Con este fin, se realizó un cribado preliminar de aquellas proteínas que podían dirigir el transporte del miR-30d a la cavidad interna de los exosomas de origen materno. Los resultados obtenidos mediante espectrometría de masas revelaron la presencia de proteínas implicadas en cambios transcripcionales, post -transcripcionales, adhesión celular o morfogénesis embrionaria (Tabla 5.1). Del conjunto de proteínas detectadas, se seleccionó la ribonucleoproteína hnRNPC1, ya que una de sus principales funciones biológicas está relacionada con el transporte de ARNm desde el citosol al citoplasma. Los estudios de co-localización de hnRNPC1 con el marcador exosomal CD63 (Figura 5.3) y los ensayos de citometría de flujo (Figura 5.4) demostraron que dicha proteína estaba presente en el interior de los exosomas y no adherida a la superficie de la membrana de estos. HnRNPC1 fue una de las primeras ribonucleoproteínas descritas en la participación de procesos de splicing del ARN (Han et al., 2010). Regula la estabilización, transporte y biogénesis del ARNm (Rajagopalan et al., 1998; Shetty, 2005), así como la traducción dependiente del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) de proteínas implicadas en la división celular y apoptosis (Holcík et al., 2003; Kim et al., 2003). HnRNPC realiza estas funciones a través de heterotetrámeros estables (Dreyfuss et al., 1993; McAfee et al., 1996) constituidos por tres moléculas de la isoforma más abundante, hnRNPC1 y una molécula de una variante ligeramente más grande, hnRNPC2 (Burd et al., 1989). Normalmente, hnRNPC1/C2 reside principalmente en el núcleo (Lee et al., 2004), pero ciertas condiciones celulares (ej: apoptosis, mitosis e infección viral) inducen la translocación de hnRNPC1/C2 del núcleo al citoplasma (Nakielny y Dreyfuss, 1996; Gustin y Sarnow, 2001; 2002; Kim y col., 2003; Lee y col., 2004; Pettit Kneller y col., 2009). De hecho, los resultados derivados del estudio de localización intracelular/subcelular de las proteínas mediante In-cell analyzer permitieron determinar que una cierta proporción de hnRNPC1 se podía detectar en el compartimento citoplasmático (Figura 5.5). La validación de la unión hnRNPC1-miR-30d mediante inmunoprecipitación y los ensayos de silenciamiento, donde se bloqueaba de manera transitoria la expresión de hnRNPC1 en células Ishikawa, constituyen evidencias tangibles del posible papel de hnRNPC1 como transportador del miR-30d. De hecho, tras el bloqueo de hnRNPC1 se pudo observar una disminución significativa de los niveles de miR-30d tanto en las células (Figura 5.7C), como en los exosomas secretados de las mismas (Figura 5.7D). Sin embargo, dicha reducción podría estar asociada también con una deficiencia en la maquinaria de biogénesis de miARNs ligada al silenciamiento de hnRNPC1. Finalmente, la prueba de concepto sobre la relevancia de la proteína hnRNPC1 en la transferencia del miR-30d proviene del co-cultivo de embriones WT o miR-30dKO con células sihnRNPC1 (Figuras 5.9, 5.10, 5.11). Se observó que el silenciamiento de hnRNPC1 compromete la detección de la señal miR-30d CY3 en toda la estructura del embrión en dos de las etapas principales de la implantación: adhesión e invasión (Figura 5.9, 5.10). Independientemente de que el embrión fuese WT o KO, los niveles de miR-30d se redujeron significativamente. A su vez, los ensayos de adhesión mostraron que el silenciamiento transitorio de hnRNPC1 produjo una disminución significativa de las tasas de adhesión en ambos genotipos, siendo esta reducción más pronunciada en los embriones KO para el miR-30d (Figura 5.11). Este efecto adverso al comienzo del proceso de implantación puede estar asociado con un efecto aditivo derivado de la ausencia del miR-30d y el silenciamiento de hnRNPC1. Teniendo en cuenta estos resultados, hnRNPC1 podría desempeñar un papel relevante en la comunicación materno-fetal mediante su participación en la biogénesis del miR-30d y su transporte posterior a las células del trofectodermo. El siguiente objetivo fue investigar el impacto de la transferencia del miR-30d, procedente de la madre o del embrión en la implantación embrionaria y desarrollo fetal. Primeramente, se caracterizó la expresión de determinados marcadores de receptividad (Cox2, Lif, Msx1, Msx2, Esr, Pgr) en úteros de ratonas no gestantes y pseudogestantes, a día 4 y 5 de pseudogestación. Los análisis mediante qPCR e inmunofluorescencia revelaron una reducción de estos marcadores en úteros de ratonas KO al comienzo del periodo de receptividad (día 4), pero no así al final del mismo (día 5) (Figura 5.12). No obstante, se demostró una reducción significativa de LIF en úteros de ratonas KO durante todo el periodo de receptividad (Figura 5.14); esta disminución de la expresión de LIF como consecuencia de la ausencia del miR-30d, resulta a priori contradictorio teniendo en cuenta que los miARNs normalmente regulan negativamente la expresión de ARNm. Sin embargo, no es la primera vez que la familia del miR-30d participa en contextos fisiológicos donde la ausencia de alguno de sus miembros da lugar a una disminución de los niveles de proteína. En este sentido, la inhibición de miR-30d en células epiteliales genera una reducción de los niveles de SOX9, a pesar de incrementar los niveles de ARNm tras alterar el mecanismo ubiquitina-proteasoma (Peck et al., 2016). Del mismo modo, se ha observado que la familia del miR-30d incrementa la síntesis proteica en células ováricas de hámster chino (CHO) al afectar la expresión de la proteína “Ubiquitin E3 ligase S-phase kinase-associated protein 2” de la ruta ubiquitina-proteasoma (Fisher et al, 2015). Por tanto, estas observaciones sugieren que el miR-30d podría regular el balance proteico en función de estímulos externos o internos, comprometiendo de esta forma procesos celulares fundamentales como la regulación del ciclo celular, expresión génica, apoptosis y/o la transducción de señales (Sadowski et al., 2012; Wang y Maldonado, 2016). A continuación, se evaluó como podía afectar la no transferencia del miR-30d, bien desde de la madre o del embrión, en el transcurso de la implantación. Para ello, se realizaron diferentes combinaciones de transferencia embrionaria en hembras WT y KO para cubrir todos los posibles escenarios de comunicación materno-fetal. Los resultados obtenidos sugieren que la deficiencia en la transferencia del miR-30d, ya sea desde la madre o desde el embrión disminuye significativamente los porcentajes de implantación alcanzados. Sin embargo, éstos se restauran significativamente en el genotipo KO tras realizar una transferencia de embriones KO pretratados con un análogo del miR-30d (Figura 5.15). El análisis de los marcadores de receptividad mediante microscopía de fluorescencia muestra una afectación significativa de LIF, especialmente en aquellos casos donde la transferencia del miR-30d está comprometida. Más aún, el patrón de variación de los porcentajes de implantación en las diferentes condiciones de transferencia coincide con el observado para los valores medios de intensidad de fluorescencia (VIF) de LIF (Figura 5.17B). En este sentido, se ha logrado identificar una correlación positiva entre el VIF medio de LIF y el porcentaje de implantación alcanzando (Figura 5.18B), sugiriendo que LIF podría ser una potencial diana indirecta del miR-30d. LIF es un regulador esencial de la implantación embrionaria en modelos murinos y un marcador de receptividad crucial en varias especies de mamíferos, incluida la humana, donde, la desregulación de la expresión de LIF se ha asociado con varios casos de infertilidad femenina debido a fallos en el proceso de implantación (Hambartsoumian et al., 1998; Mikolajazyk et al., 2007; Franasiak et al., 2014). LIF alcanza su máxima expresión en el epitelio glandular endometrial momentos antes de que la implantación tenga lugar, promoviendo la activación de vías de señalización cruciales para este proceso [ej.: JAK/STAT3, MAPK y fosfatidilinositol-3 quinasa (PI3K)] (Aghajova, 2010). En la literatura, se han descrito casos en los que la regulación de LIF es controlada por medio de miARNs. En este sentido, existen evidencias de que la expresión del ARNm de LIF es prácticamente opuesta a la del miR-181a y miR-181b durante el embarazo (Chu et al., 2015). Del mismo modo, se ha visto que miR-223-39 afecta a la implantación embrionaria suprimiendo la expresión de LIF y la generación de pinópodos en el endometrio de ratonas gestantes (Dong et al., 2016). Es importante tener en cuenta que la mayoría de las investigaciones que se centran en el estudio del papel de los miARNs sobre la receptividad endometrial destacan el efecto ejercido por el endometrio sobre el embrión, pero no la posible influencia de este último en la adquisición de un endometrio receptivo. El enfoque más cercano hasta la fecha describe que las células epiteliales endometriales humanas (hEECs) son capaces de adquirir miR-661, un miARN presente en el medio condicionado de blastocistos no implantados, dando como resultado una disminución de la tasa de adhesión de trofoblastos (Cuman et al. 2016). De forma similar, la infusión de vesículas extracelulares fluorescentes de origen embrionario en cuernos uterinos de ovejas permitió la detección de fluorescencia en el citoplasma del epitelio luminal y glandular. Por lo tanto, estos estudios establecen que los miARNs extracelulares originarios del embrión son internalizados por las células uterinas y modulan la expresión génica materna, hecho que indica un papel funcional de la señalización entre el blastocisto y el endometrio materno durante la ventana de implantación. En este contexto, los resultados de esta tesis evidencian que los miARNs transferidos desde los embriones en las primeras etapas de desarrollo tienen un impacto en la función endometrial. De hecho, como se ha indicado anteriormente, el pretratamiento de embriones KO con un análogo del miR-30d no sólo aumentó los valores de intensidad de fluorescencia de LIF en receptoras KO, sino también el porcentaje de implantación registrado (Figura 5.15, 5.16 y 5.17). Hasta la fecha, el fallo de implantación se ha asociado con determinados efectos adversos durante el embarazo, incluidos el retraso de crecimiento feto-placentario y la existencia de elevadas tasas de reabsorción (Song et al., 2002; Ye et al., 2005). Estas características fueron evaluadas en los genotipos WT y KO en los días 5, 6, 8 y 12 de embarazo. Los sitios de implantación son significativamente más pequeños en hembras KO a lo largo de los diferentes tiempos de gestación analizados (Figura 5.19A). Además, los sitios de reabsorción son más evidentes en el genotipo KO (Figura 5.19B). Sin embargo, el rasgo fenotípico más relevante es el retraso en el crecimiento feto-placentario en los fetos KO evaluado a través de los parámetros de longitud céfalo-caudal y los ratios peso feto/peso placenta (Figura 5.20). Estos resultados sugieren una leve afectación del desarrollo placentario, asociada a la disminución de los niveles de miR-30d. Este fenotipo deficiente de implantación puede tener su origen en una posible alteración de las transiciones epitelio-mesenquimales (EMT). Durante el desarrollo normal de la placenta, el citotrofoblasto velloso se diferencia en trofoblasto extravelloso (EVT) más invasivo, un proceso marcado por la existencia de una transición epitelial-mesenquimal (Dasilva-Arnold et al., 2014). Su desregulación está asociada con metástasis tumorales y progresión del cáncer (Kalluri et al., 2009; Davies et al., 2016), así como con trastornos en el embarazo, incluyendo la preeclampsia, la restricción del crecimiento fetal (FGR) (Du et al., 2017) o la endometriosis (Mari-Alexandre et al, 2016). Estudios recientes sugieren que la EMT durante la implantación está parcialmente regulada por los niveles de miR-30d (Cai et al., 2016); específicamente, la expresión reducida de miR-30d promueve la EMT y la invasividad que afectan la receptividad endometrial. Teniendo eso en cuenta, es factible que la EMT pueda verse afectada en el modelo murino KO debido a la desregulación del miR-30d. Como resultado, el desarrollo de la vascularización fetal y materna responsable del intercambio de nutrientes podría estar comprometido, lo que podría explicar porque los ratones miR-30d KO presentan pesos, anchuras y longitudes significativamente inferiores que el genotipo WT (Figura 5.20 F, G, H). Es importante tener en cuenta que la disfuncionalidad de la transición epitelio-mesenquimal en trastornos del embarazo tiene su origen en una decidualización defectuosa. LIF es un regulador esencial de este proceso, ya que los úteros de ratones Lif -/- no son capaces de decidualizar, incluso bajo los efectos de los estímulos inductores de dicho proceso. Por lo tanto, el defecto en el desarrollo en el modelo KO podría tener su origen en toda la sucesión de eventos desencadenados por LIF, aunque hay que tener en cuenta que, dado que los miARNs afectan a la expresión de miles de ARNm (Mehta et al., 2016), los defectos observados podrían deberse a efectos pleiotrópicos del miR-30d. De hecho, puesto que los experimentos realizados solo evidencian parte del potencial de este miARN, sería necesario continuar la investigación para dilucidar por completo la regulación de la receptividad endometrial mediada por el miR-30d. Sin embargo, la hipótesis inicial en la que se planteaba un posible papel del miR-30d en la interfaz materno-fetal se cumple dados los efectos observados en la adquisición de un endometrio receptivo y el posterior desarrollo del embrión. Por otro lado, con respecto al modo de internalización del miR-30d en el interior de exosomas, se precisan más experimentos para determinar de qué manera se establece un enlace entre la proteína hnRNPC1 y el miARN antes de su liberación al ambiente intrauterino. Conclusiones Los ensayos de espectrometría de masas identificaron hnRNPC1 como la proteína responsable, al menos en parte, del transporte del miR-30d al interior de la cavidad exosomal de células epiteliales endometriales humanas. Asimismo, análisis posteriores verificaron tanto la presencia de hnRNPC1 en exosomas, así como la interacción miR-30d-hnRNPC1 en el interior de los mismos. El silenciamiento de hnRNPC1 en células Ishikawa redujo los niveles de miR-30d tanto en dichas células como en los exosomas derivados de las mismas, sugiriendo un posible papel de hnRNPC1 en la biogénesis del miR-30d. A su vez, el bloqueo transitorio de hnRNPC1, dio lugar a una disminución significativa de las tasas de adhesión de embriones WT y KO para el miR-30d, siendo dicha disminución más significativa en el genotipo KO. El análisis de los marcadores de receptividad en el modelo animal demuestra que la ausencia del miR-30d afecta a la expresión de LIF durante toda la ventana de implantación tanto en condiciones de pseudogestación como en diferentes contextos de comunicación materno-fetal. En este último caso, la transferencia de embriones KO pretratados con un análogo del miR-30d permite reestablecer los niveles basales de fluorescencia de LIF tanto en úteros WT como KO. El análisis del fenotipo de implantación en diferentes contextos de comunicación materno-fetal reveló que el bloqueó de la transferencia del miR-30d, ya sea desde la madre o el embrión, reduce significativamente las tasas de implantación alcanzadas.