NtcA, es un factor de transcripción cianobacteriano perteneciente a la familia CRP. Es considerado el regulador global del nitrógeno en cianobacterias ya que presenta un regulón muy amplio que incluye muchos genes implicados en el metabolismo de nitrógeno. Se activa por 2-oxoglutarato(2-OG), un indicador del nivel de nitrógeno celular y es coactivado por una proteína llamada PipX, objeto importante de este estudio. A bajo nivel de 2-OG, PipX es secuestrada por la proteína señalizadora PII quedando inaccesible para activar NtcA. Sin embargo, la unión de 2-OG a PII en condiciones de escasez de nitrógeno, libera PipX, la cual queda accesible para coactivar NtcA. Las estructuras de NtcA unido a 2-OG, así como a PipX y 2-OG ya habían sido determinadas previamente en nuestro laboratorio, en esta tesis presentamos la estructura de NtcA unido a su DNA diana y también la estructura del complejo NtcA-PipX-DNA. Estas estructuras aclaran el mecanismo de la especificidad de NtcA por el DNA y muestran que PipX no interacciona con este, sino que estabiliza la conformación activa de NtcA. Así, la unión de PipX a NtcA desplaza el equilibrio entre las formas inactivas del factor de transcripción en favor de su forma competente para unir DNA. Aquí presentamos la estructura de tres formas inactivas de NtcA, sin 2OG unido, demostrando que la conformación inactiva no es específica de especie, sino que existen varias conformaciones inactivas para cada especie. Además, en el complejo PII-PipX, la hélice C-terminal de PipX se encuentra extendida, proporcionando una oportunidad para interaccionar con otras posibles dianas, lo que no podría ocurrir en el complejo NtcA-PipX, donde dicha hélice está siempre flexionada. Nosotros hemos propiciado la determinación de la estructura de PipX por RMN, probando que PipX cuando está libre, presenta su hélice C-terminal flexionada. Recientemente, un regulador génico putativo ha sido identificado como una diana de PipX en el complejo ternario PII-PipX-PlmA. Ya que solo elementos de PipX parecen interaccionar con PlmA en este complejo ternario, parece que PII actúa como un “abridor” de la hélice C-terminal de PipX, promoviendo el secuestro de PlmA en este complejo. Por otra parte, mediante resonancia de plasmón hemos investigado la unión de las proteínas NtcA y CRP a promotores con secuencias consenso canónicas y no canónicas, en ausencia y presencia de sus efectores (2OG y cAMP respectivamente) y/o de la proteína PipX para estudiar qué hace a algunos genes del regulón de NtcA más o menos sensibles a NtcA dependiendo de la presencia o ausencia de 2OG y PipX, y la posible activación cruzada de los promotores de NtcA o CRP, ya que ambos reconocen secuencias de DNA similares. Los resultados muestran que NtcA puede unirse a los promotores dependientes de CRP pero no al revés, además que CRP es incapaz de unirse a su promotor en ausencia de cAMP mientras que NtcA si se une a sus promotores en ausencia de 2OG, aunque con una afinidad menor que en su presencia. También hemos encontrado que la afinidad efectiva de NtcA por el 2OG está muy influenciada por el promotor y que PipX aumenta esta afinidad de forma importante, uniéndose solo a NtcA en presencia de 2OG, apoyando la visión de que PipX estabiliza la conformación activa de NtcA unida a 2OG.

NtcA is a cyanobacterial transcriptional regulator from the CRP family of transcription factors. It is considered as the global nitrogen regulator of cyanobacteria because it controls an extense regulon that includes many genes involved in nitrogen metabolism. NtcA is activated by 2-oxoglutarate (2-OG), an indicator of low nitrogen levels in the cell and it is coactivated by protein PipX, an important object of this study. At low 2-OG levels, PipX is sequestered by the PII signaling protein, which makes PipX inaccessible to activate NtcA. However, the binding of 2-OG to PII under nitrogen deprivation conditions releases PipX, rendering it accessible to co-activate NtcA. Structures of NtcA bound to 2-OG in the absence and in the presence of PipX had been previously determined in our laboratory; in this thesis we describe the structure of NtcA bound to its target DNA and also the structure of the NtcA-PipX-DNA complex. These structures clarifies the mechanism of NtcA specificity for its DNA box and also clearly show that PipX does not interact with DNA, but it stabilizes the active conformation of NtcA. Thus, the binding of PipX to NtcA displaces the balance between the multiple inactive forms of the transcription factor in favor of its DNA binding competent form. Here we present also the structure of three inactive forms of NtcA, without 2OG bound, demonstrating that the inactive conformation is not species specific, but that there are several inactive conformations for each species. In addition, in the PII-PipX complex, the C-terminal helix of PipX is extended, providing an opportunity of interaction with other possible targets, which could not occur in the NtcA-PipX complex, where this helix is always flexed. We have propitiated the determination of the PipX structure by NMR, proving that PipX when free, presents its C-terminal helix flexed. Recently, a putative gene regulator has been identified as a target of PipX in the PII-PipX-PlmA ternary complex. Since only PipX elements seem to interact with PlmA in this ternary complex, it seems that PII acts as an "opener" of the C-terminal helix of PipX, promoting the sequestration of PlmA in this complex. On the other hand, by using plasmon resonance technique, we have investigated the binding of NtcA and CRP proteins to promoters with canonical and non-canonical consensus sequences for these transcriptional regulators in the absence and in the presence of their respective effectors (2OG and cAMP respectively) and /or the PipX protein. These experiments were done in order to study what makes some genes of the NtcA regulon more or less sensitive to NtcA depending on the presence or absence of 2OG and PipX, and also to test the possibility of cross-activation betwen NtcA and CRP promoters, due to both transcription factors recognize similar DNA sequences. Our results show that NtcA is able bind to the CRP-dependent promoters but not the other way around. In addition to that, CRP is unable to bind to its own promoter in the absence of cAMP whereas NtcA does bind to its promoters in the absence of 2OG, albeit with less affinity than in his presence. We have also found that the effective affinity of NtcA for 2OG is highly influenced by the promoter and that PipX increases this affinity in an important way, interacting only with NtcA when 2OG is present, supporting the view that PipX stabilizes the active conformation of bound NtcA to 2OG.