Introducción Desde la aplicación de la Terapia Antirretroviral de Gran Actividad (TARGA) la supervivencia de los sujetos infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se ha incrementado considerablemente; sin embargo, su expectativa de vida es todavía 10 años menor a la de la media de la población. Esta reducción es debida a enfermedades no relacionadas con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Entre las principales causantes de este descenso se encuentra el aumento de la incidencia de problemas cardiovasculares. Recientemente, se ha descrito que la activación inmune persistente y la inflamación crónica son dos factores implicados en la morbimortalidad de estos pacientes. Un acontecimiento central en la fisiopatología del VIH es la destrucción, en fases muy tempranas de la infección, de los linfocitos Th17 del tejido linfoide asociado a mucosa (TLAM), órgano en el que residen alrededor del 90% del acervo de linfocitos totales. Junto al daño del TLAM tiene lugar apoptosis de las células epiteliales y la pérdida de la integridad de la mucosa que conduce a una translocación bacteriana anormal que se cree responsable de la inmunoactivación sistémica observada en los sujetos con VIH. Fisiológicamente las células Th17 juegan un papel crucial en la defensa frente a la translocación bacteriana, ya que estimulan la proliferación de células epiteliales y la expresión de defensinas antibacterianas, al mismo tiempo que promueven la quimiotaxis de neutrófilos hacia el TLAM para eliminar los productos bacterianos. Por tanto, la pérdida masiva de linfocitos Th17 determina probablemente el aumento de translocación bacteriana observado en la infección por VIH. Recientemente, por otro lado, se ha observado que el cambio en la composición de la microbiota intestinal asociada a la infección por el VIH está relacionada con la pérdida del TLAM, lo que podría, a su vez, ser una de las principales causas de la inflamación sistémica. Objetivos El objetivo principal de la presente tesis es caracterizar la comunidad microbioma intestinal disbiótica tanto en su composición como en su función, así como estudiar su efecto en la immunoactivación sistémica. Como objetivo secundario, abordaremos el estudio del efecto de una intervención nutricional dirigida a modificar la composición bacteriana intestinal hacia una comunidad menos inflamatoria. Materiales y métodos Para estudiar el efecto de la infección del VIH sobre la microbiota intestinal humana, se reclutó una corte de sujetos HIV+ sin TARGA, sujetos HIV+ con respuesta positiva al TARGA, sujetos HIV+ con respuesta negativa al TARGA y sujetos sanos como controles. Adicionalmente, se realizó una intervención nutricional de seis semanas de 5 g de galacto-oligosacáridos de cadena corta (Purimune®), 10 g de fructooligosacáridos de cadena larga (Orafti-HP® y Actilight®) y 5 g de glutamina (Nutrición Médica®) y placebo (20 g de maltodextrina). De cada integrante de la cohorte se recogieron muestras fecales y sanguíneas, antes y después de la intervención nutricional, con el fin de poder caracterizar la microbiota intestinal, así como medir marcadores de activación inmune, inflamación sistémica y translocación bacteriana. La microbiota intestinal se caracterizó recurriendo a técnicas de metagenómica, metatranscriptómica y meta-metabolómica. Para cada una de las muestras sanguíneas se obtuvieron distintos marcadores de activación inmune sistémica innata, adaptativa, translocación bacteriana, así como un análisis completo de la química sanguínea de cada uno de los participantes de la cohorte. La medición de dichos marcadores se llevó a cabo en colaboración con el Hospital Universitario Virgen del Rocío (Sevilla) y el Departamento de Enfermedades Infecciosas del Hospital Universitario Ramón y Cajal (Madrid) De las muestras fecales se extrajo el ADN y el ARN bacterianos para posteriormente poder secuenciarlo por medio de la combinación de las tecnologías de pirosecuenciación (Roche GS FLX y química de Titanium) y secuenciación de cadenas pareadas de Illumnina (Miseq química V3). Del ADN bacteriano se amplificó el gen ribosómico 16S con el fin de poder llevar a cabo luego la caracterización taxonómica de la comunidad bacteriana correspondiente. La secuenciación masiva fue realizada en el área de Genómica y Salud de la Fundación para el Fomento de la Investigación Sanitaria y Biomédica de la Comunitat Valenciana (FISABIO) En colaboración con el Centro de Metabolómica y Bioanálisis (CEMBIO de la, Universidad CEU San Pablo (Madrid, España), obtuvimos el perfil metabólico de las comunidades bacterianas residentes del intestino humano. Los meta-metabolomas se determinaron por medio de la extracción de los metabolitos totales para, posteriormente, separarlos mediante la aplicación de una cromatografía líquida de alta eficacia acoplada a un espectrómetro de masas ESI-QTOF. Los metabolitos fueron identificados por medio del servidor web MELTIN, las bases de datos Lipidomics Gateway database y KEGG. Del mismo modo, en colaboración con el Departamento de Tecnología Alimentaria del Centro Agrotécnico, Universidad de Lleida (España), obtuvimos las mediciones de los ácidos grasos de cadena corta (AGCC). La anotación funcional de las secuencias de metagenomas se realizó mediante el ensamblaje de los metagenomas, recurriendo al programa Ray-Meta. La predicción de los marcos de lectura abiertos (MLA) la determinamos recurriendo al programa MetaGeneMark. De forma similar, los metatranscriptomas se ensamblaron recurriendo al programa Trinity y sus MLA se predijeron por el programa TransDecoder.LongOrfs. A partir de los MLA de los metagenomas y de los metatranscriptomas creamos una base de datos no redundante de MLA aplicando el programa USEARCH. Esta base de datos se comparó, recurriendo al programa rapsearch2 con la base de datos funcionales KEGG y la base de datos de resistencias a antibióticos CARD. La cuantificación de cada MLA se llevó a cabo de forma separada para metagenomas y metatranscriptomas, recurriendo en el primer caso al programa soap.coverage, y el RSEM para el segundo. La anotación taxonómica de las secuencias se realizó utilizando el mapeo de las secuencias de los metagenomas y metatranscriptomas contra una base de datos no redundante de genomas de referencia de especies residentes del microbioma humano. Para el caso de las secuencias de los amplicones del gen ribosómico 16S recurrimos al paquete de programas de análisis ecológico Qiime. La identificación de los biomarcadores relativos a las condiciones HIV+ o HIV-, así como los subgrupos correspondientes de los HIV+, se identificaron por medio del programa LEfSe, de forma indistinta para las anotaciones taxonómicas y funcionales. Recurrimos a Qiime y el programa de análisis estadístico R (v.3.3) para llevar a cabo análisis de diversidad alfa y beta. Así mismo, el programa de análisis estadístico R se utilizó para realizar los análisis de correlación, regresión lineal, pruebas de rango, los modelos generalizados lineales, las redes bayesianas, las redes ecológicas y funcionales, así como el resto de los análisis estadísticos de la presente tesis. Resultados y discusión La alteración de la mucosa intestinal provocada por el VIH genera una disbiosis que se detecta a partir de la comparación de los datos provenientes de la metagenómica, la metatranscriptómica y la meta-metabolómica en las diferentes cohortes del estudio. Del mismo modo se observa una correlación con las variables clínicas de activación inmune e inflamación sistémica. La disbiosis se caracteriza por el incremento de bacterias Gram-negativas capaces de resistir el estrés oxidativo generado por la inflamación intestinal. Varios compuestos metabólicos de esta comunidad bacteriana, tales como los lipopolisacáridos de membrana, son potentes activadores de la respuesta inmune e inflamatoria. Por otro lado, varias especies bacterianas conocidas por tener un papel antinflamatorio o ser importantes productoras de AGCC ven disminuida su abundancia en el microbioma asociado a los pacientes infectados por el VIH. La pérdida de dichas especies se ve reflejada en una reducción de la concentración de los AGCC en el intestino. Los AGCC, en especial el ácido butírico, poseen efectos beneficiosos sobre la salud del hospedador. Estos ayudan a la producción de mucina, la integridad de las uniones ocluyentes, la diferenciación de las células T reguladoras y la regeneración de la barrera epitelial. La disbiosis asociada al VIH no se ve aminorada por el uso de TARGA y la incorporación del prebiótico mostró un efecto moderado en la mayoría de los participantes. Sin embargo, dicho efecto fue más notorio en los individuos del grupo HIV+ sin TARGA. La administración del prebiótico mostró un incremento en la abundancia de especies productoras de ácido butírico junto con una mayor producción de este ácido graso. Este incremento correlacionaba con una reducción en la translocación bacteriana y la reducción de los marcadores de inflamación sistémica. El análisis de redes reveló que la comunidad bacteriana asociada al VIH muestra propiedades de "red biológica". Esto implica que esta comunidad disbiótica es capaz de conformar una comunidad estable que está asociada al deterioro de la salud del paciente. Adicionalmente, las especies y genes que se han enriquecido o perdido en la comunidad bacteriana intestinal asociada al VIH son componentes fundamentales que mantienen la estructura de las redes ecológicas y metabólicas correspondiente. Así, las especies que están sobrerrepresentadas en la condición del VIH influyen fuertemente en el resto de la comunidad de bacterias. Por otro lado, la infección del VIH causa cambios dramáticos en la estructura metabólica del microbioma intestinal perdiendo y ganando importantes enzimas metabólicas. Aunque se deben realizar estudios longitudinales adicionales, así como incrementar el tamaño muestral de participantes, en la presente tesis mostramos en forma holística el papel fundamental que el microbioma intestinal tiene en la patogénesis de la infección por el VIH. Más importante aún, proponemos, por un lado, que la microbiota puede ser objeto de intervención clínica en pacientes infectados con el VIH y, por otro, sugerimos posibles candidatos bacterianos probióticos capaces de dar respuestas viables en las correspondientes intervenciones.

The use of ART in HIV+ subjects has increased considerably the life expectancy restoring the CD4+ T-cell counts and maintaining at low levels the viral load. However, their life expectancy is 10 years lower than the average population. This reduction is given due to unrelated AIDS illness, such as cardiovascular diseases and atherosclerosis that are caused by persistent immune activation and chronic inflammation. A possible explanation for this phenomenon is a constant bacterial translocation from the intestinal lumen to the systemic circulation given a prior disruption of the GALT. Moreover, the loss of the lymphoid tissue leads to a microbial imbalance that could be related to the systemic immune activation. In the present thesis, we describe in a holistic way the fundamental role of the microbiome in the pathogenesis of HIV infection. Here we present the results of a cross-sectional study of a cohort of three different HIV-infected groups of subjects (with a different response to the ART) and controls target to understand the alterations of the gut-microbiome given the HIV infection. The microbiome was characterized implementing different “omic” technologies and the impact on the host health was determined based on measuring clinical data related to the immune response and the bacterial translocation. Finally, a pilot study based on dietary supplementation with prebiotics and glutamine was carried out with the aim of ameliorating the HIV-associated dysbiosis. The HIV infection causes a disruption of the GALT leading the dysbiosis of the microbial community that cannot be restored by the ART. Moreover, the infection time would affect the diversity of the microbiota and the ecosystem stability. This dysbiotic community is enriched in Gram-negative species which are adapted to the inflammatory environment of the gut produced by HIV infection and produces pro-inflammatory metabolites which trigger the systemic immune activation and inflammation. Moreover, the HIV-dysbiosis is depleted for SCFA producer species and in the expression of genes related to anti-inflammatory metabolic pathways such as butanoate metabolism, propanoate metabolism or fatty acid metabolism. The prebiotic has an effect on a community whose original configuration is receptive to the nutritional intervention; this is related to the time exposure to HIV infection. The prebiotic intervention increases the butyrate levels by means of the increase of SCFA-producer species such as Faecalibacterium sp. The increment of the levels of the butyrate is related to the decrease of the bacterial translocation and systemic inflammation. Finally, we show that the dysbiotic-community is able to establish a stable-community which is associated with the deterioration of the patient's health. More importantly, we suggest that the microbiota may be a new target for clinical interventions in patients infected with HIV and proposed putative candidates for been viable targets for such interventions.