Resumen – Discusión de los resultados. En la presente Tesis Doctoral se han desarrollado diversas rutas de síntesis para la obtención de alcaloides isoquinoleínicos, con diferentes esqueletos, y de hexahidroindenopiridinas. Además se han realizado sus correspondientes ensayos farmacológicos, sobre distintas dianas biológicas basándonos en los resultados obtenidos previamente con este tipo de alcaloides de síntesis y/o aislados de la naturaleza, y de moléculas estructuralmente similares. Se ha observado, a lo largo de muchos años, que las IQ son uno de los metabolitos secundarios activos (MSA) más abundantes y de mayor interés farmacológico de los aislados en especies de la familia de las Annonáceas. Las azafluorenonas, alcaloides piridínicos presentes también en Annonáceas, y con propiedades antipalúdicas, nos has servido de inspiración para la síntesis de las HHIP. Los dianas biológicas para las que se ha desarrollado la síntesis de estos nuevos fármacos son: a)- IQ con afinidad por los Receptores Dopaminérgicos D1 y D2. b)- HHIP con afinidad por los Receptores Melatoninérgicos MT1 y MT2. c)- IQ con actividad antimicrobiana. d)- IQ con actividad antitumoral. Así pues, los Artículos que forman parte de la presente Tesis Doctoral se pueden dividir en tres capítulos: Capítulo 1: Alcaloides Isoquinoleínicos con afinidad por los Receptores Dopaminérgicos - Modelización Molecular sobre Receptores Dopaminérgicos: Artículos 1, 2 y 3. Capítulo 2: Alcaloides Indenopiridínicos con afinidad por los Receptores Melatoninérgicos: Artículos 4 y 5. Capítulo 3: Alcaloides Isoquinoleínicos con actividad antimicrobiana y antitumoral: Artículos 6 y 7. Capítulo 1. Artículo 1: “2,3,9- and 2,3,11- Trisubstituted tetrahydroprotoberberines as D2 dopaminergic ligands ” (En: European Journal of Medicinal Chemistry, 2013, 68, 150) La dopamina es un neurotransmisor que tiene una importante función en el sistema nervioso central. Un desorden en el sistema dopaminérgico conduce a la aparición de alteraciones neurológicas y psiquiátricas importantes como la esquizofrenia y/o la enfermedad de Parkinson. Por lo tanto, la investigación en este campo tratará de sintetizar nuevos fármacos que posean una mayor afinidad por los RD D1 y D2 y poder paliar este tipo de enfermedades. Las tetrahidroprotoberberinas (THPB) son compuestos naturales existentes en diferentes especies vegetales, presentes como metabolitos secundarios activos (MSA). Este tipo de alcaloide isoquinoleínico contiene diversas actividades farmacológicas, incluyendo entre ellas la afinidad por los receptores dopaminérgicos (RD). Con el objetivo de mejorar la unión a dichos receptores, se desarrolló una ruta sintética mediante la que se obtuvieron tres series de THPB, obteniendo once moléculas finales a ensayar (Figura 19). Figura 19. Series de THPB. Existen diferentes métodos para la obtención de THPB. La ruta sintética que seguimos consta de cinco etapas. La primera es una reacción de Henry, mediante la cual se obtiene el β-nitroestireno. Esta va seguida de una reducción para conseguir la feniletilamina, producto de partida en la siguiente etapa, para dar lugar, reaccionando con el cloruro de ácido adecuado, a la fenilacetamida correspondiente. A continuación, mediante una ciclodeshidratación de Bischler-Napieralski y posterior reducción, la fenilacetamida genera la 1-bencil-THIQ, producto de partida en la ciclación de Mannich mediante la cual se obtiene la THPB de interés. En este trabajo se ha estudiado la influencia de los sustituyentes sobre los anillos A y D de las THPB sintetizadas, en la afinidad por los RD. Así pues, se observó que la presencia de hidroxilos en el anillo A da lugar a un aumento de la afinidad por los RD D1 y D2 con respecto a los análogos que presentan las funciones oxigenadas bloqueadas. La presencia de un halógeno en el anillo A provoca un aumento de la afinidad por los RD D1, disminuyendo así la selectividad por los RD D2. Además se observó que la existencia de un grupo metilendioxi en las posiciones 2,3 produce una disminución de la selectividad por RD D2. En cuanto a los sustituyentes en el anillo D, la presencia de un grupo hidroxilo en posición 9 causa un aumento de la afinidad tanto por el RD D1 como por el D2, mientras que un hidroxilo en posición 11disminuye dicha afinidad (Figura 20). Así podemos destacar entre las 11 moléculas ensayadas 9f (2,3‐OCH2O‐9‐OH), 6b (2,3‐diOH‐11‐MeO) y 9d (2,3,9‐triOH) por presentar mayor afinidad por los RD D2, y siendo esta última (9d) la que mostró mayor selectividad (ratio Ki D1/D2 de 40.6). Figura 20. Curvas de desplazamiento de [3H]-SCH 23390 (D1) y [3H] raclopride (D2) de binding específico para 9e y 9f. Datos obtenidos de 3-5 experimentos. Para entender mejor la interacción molecular que se establece entre los fármacos sintetizados y los RD D2, se realizaron estudios de modelización molecular mediante simulaciones moleculares dinámicas y cálculos mecánico cuánticos de tres de las THPB más activas (9c, 9d y 6b). De estas simulaciones se pudo concluir que las interacciones más importantes en la unión fármaco-receptor son las establecidas entre el Asp 114 y la amina protonada con carga positiva de la THPB y entre Ser 193 y/o Ser 194 y el grupo catecol del anillo A. Además, se observó que de las tres moléculas ensayadas la THPB 9d era la que mostraba ser más afín sobre el RD D2, puesto que poseía una elevada energía en la interacción con dicho receptor. Además, se realizaron ensayos de toxicidad celular en neutrófilos humanos, mediante técnica de MTT y de citometría de flujo, en las que se determinó que ninguna de las THPB sintetizadas eran citotóxicas. Artículo 2: “Synthesis of hexahydrocyclopenta[ij]isoquinolines as a new class of a dopaminergic agents” (En: European Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 90, 101) Las THIQ son alcaloides naturales presentes en multitud de especies vegetales biosintetizados a partir de la tirosina y de la dopamina, por lo que se ha estudiado la afinidad de estos compuestos por los RD. En el Artículo 2 se ha desarrollado la síntesis de una serie de alcaloides tricíclicos llamados 1,2,3,7,8,8a-hexahidrociclopenta[ij]-isoquinoleínas (HCPIQ) con la finalidad de optimizar y mejorar la afinidad por los RD D1 y D2. La síntesis de este tipo de IQ comienza con la condensación de una feniletilamina y de un cloruro de ácido, que mediante condiciones de Schotten-Baumann darán lugar a la correspondiente fenilacetamida. Una ciclodeshidratación de Bischler-Napieralski seguida de una reducción de la imina intermediaria, genera el esqueleto IQ. La última etapa es una ciclación intramolecular mediante condiciones de Friedel-Crafts en la que se usa el reactivo de Eaton, generando en esta etapa el anillo ciclopentano (Figura 21). Reactivos y condiciones: (a) cloruro de cinnamoilo, CH2Cl2, NaOH 5 %, ta, 3h; (b) POCl3, acetonitrilo, N2, reflujo, 5h; (c) NaBH4; MeOH, ta, 2h; (d) Reactivo de Eaton (P2O5-CH3SO3H, 1:10 w/w), reflujo, 15h; (e) CH2Cl2, BBr3, ta, 2h; (f) metanol, formaldehido, acido fórmico, reflujo, 1h, seguido de NaBH4, reflujo, 1h; (g) CH3CN, K2CO3,cloruro de alilo, reflujo, 10h. Figura 21. Esquema sintético de las HCPIQ. En cuanto a la afinidad por los RD D1 y D2, se observó que todas las HCPIQ sintetizadas eran capaces de desplazar a los radioligandos específicos ([3H]-SCH 23390 (D1) y [3H] raclopride (D2)). Como en el caso de las THPB, aquellas que presentaban los hidroxilos libres poseían mayor capacidad de unión por los RD que los análogos correspondientes con los grupos oxigenados bloqueados. Las HCPIQ 3a, 3c y 3e poseían valores excepcionales de afinidad sobre los RD D2, 29, 13 y 18 nM respectivamente. Además, se observó, en toda la serie de este tipo de IQ, una muy elevada selectividad sobre los RD D2, destacando los compuestos 3a y 3c, con un valor de ratio D1/D2 de 2465 y 1010 respectivamente. En este trabajo también se realizaron ensayos de toxicidad celular sobre neutrófilos humanos, determinándose que ninguna de las HCPIQ sintetizadas eran citotóxicas. Artículo 3: “3-Chlorotyramine Acting as Ligand of the D2 Dopamine Receptor. Molecular Modeling, Synthesis and D2 Receptor Affinity” (En: Molecular informatics, 2014, in press) En este trabajo, se realizaron estudios de modelización molecular en los cuales se evaluaron las interacciones entre los compuestos y el RD D2 mediante la combinación de simulaciones de dinámica molecular (MD), semiempírica, ab initio y cálculos teóricos basados en el funcional de la densidad (DFT). En el segundo, se hizo uso de sistemas modelo reducido que nos permitió llevar a cabo cálculos de mecánica cuántica y estudios tipo teoría cuántica de átomos en moléculas (QTAIM). Figura 22. Dopamina y análogos clorados De las energías de unión obtenidas en las simulaciones se puede observar que la sustitución de un hidroxilo por un átomo de cloro (Figura 22, compuesto 3), aumenta la afinidad por el RD D2 en comparación con la dopamina (1). Sin embargo, la sustitución del OH en posición para por el cloro (2) ejerce el efecto contrario. Como ya se había sugerido en artículos anteriores del grupo del profesor Ricardo D. Enriz, que colabora activamente con nuestro grupo de investigación, la existencia de un resto carboxilo en el lugar de unión es muy importante para la interacción ligando-receptor, puesto que la fuerte interacción de los ligandos con el Asp 114 se mantuvo para todos los complejos evaluados. Respecto a la Val 115 (Figura 23), este aminoácido forma diversas interacciones con el anillo aromático de la dopamina. En cuanto a los restos serina, la Ser 197 aporta la mayor contribución a las energías de interacción de los complejos con los compuestos que poseen un hidroxilo en meta (1 y 2), mientras que la Ser 193 es más importante para el compuesto que tiene un cloro en esta posición (3). Por otro lado, el análisis de descomposición de residuos también revela una destacable contribución de la Phe 389, siendo más importante en el caso de los compuestos con hidroxilo en para (1 y 3). Figura 23. Energías de interacción para el compuesto 3. Capítulo 2. Artículo 4: “Synthesis of new melatoninergic hexahydroindenopyridines” (En: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24, 3534) Las hexahidroindenopiridinas (HHIP) son moléculas alcaloídicas con un esqueleto novedoso que genera una nueva clase de compuestos con posible utilidad como agentes terapéuticos. Las HHIP se conocen por poseer varias actividades farmacológicas como lo son su actividad antiespermatogénica, antidepresiva y serotoninérgica, entre otras. Con objeto de obtener HHIP con diferentes sustituciones sobre posiciones clave dentro del esqueleto: posiciones 1, 7 y 8, que pudieran interaccionar selectivamente sobre los receptores de la melatonina, se desarrolló la siguiente ruta sintética (Figura 24). Reactivos y condiciones: (a) piperidina, TiCl4, tolueno seco, N2, ta, 3 días; (b) Hidrobromuro de 3-bromopropilamina, DMF seco, 110 ºC, 8 h; (c) NaBH4, EtOH, ta, 16 h. Figura 24. Ruta sintética para la obtención de HHIP 1b y 2b. En ella, se parte de 1-indanonas sustituidas en posiciones 5 y/o 6, comercialmente disponibles, y mediante una reacción catalítica con TiCl4 y piridina se produce la formación de la enamina correspondiente; la cual es sometida a una reacción de ciclación en la que se hace reaccionar con el hidrobromuro de 3-bromopropilamina, seguida de una reducción con borohidruro sódico, obteniendo así el esqueleto HHIP. A continuación se llevó a cabo la funcionalización del nitrógeno de las HHIP sintetizadas, para dar lugar a los compuestos que pudieran mimetizar los efectos de la melatonina sobre sus receptores específicos. De esta forma se prepararon por métodos clásicos los derivados N-acetilados, carbamatos y N-alquilados. Estudios preliminares de binding melatoninérgico de las HHIP sintetizadas, mostraron que dicho esqueleto convenientemente funcionalizado, constituye un farmacóforo adecuado con capacidad para unirse a los receptores de la melatonina MT1 y/o MT2, y de esta forma conseguir un nuevo agente inductor del sueño. Artículo 5: “Efficient synthesis of hexahydroindenopyridines and their potencial as melatoninergic ligands” (En: European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 86, 700) La melatonina es una neurohormona que está implicado en procesos celulares, neuroendocrinos y neurofisiológicos. Se ha observado que alteraciones en el sistema melatoninérgico conducen a la aparición de enfermedades como insomnio y depresión, por lo que la investigación en este campo tiene como objetivo crear fármacos nuevos que posean una elevada afinidad por MT1 y MT2. Las hexahidroindenopiridinas (HHIP) son alcaloides tricíclicos que muestran semejanza estructural con la melatonina y con otros fármacos recientemente comercializados, como la agomelatina (Valdoxan®), indicados en problemas de insomnio. Es por ello que las HHIP han sido estudiadas por nuestro grupo, con objeto de obtener análogos con una mayor afinidad por los receptores melatoninérgicos (Figura 25). Figura 25. Melatonina, Agomelatina y HHIP. En este artículo se sintetizaron veinticinco HHIP, clasificados en 4 series, con una diferente sustitución sobre las posiciones 7 y 8 (Anillo A), dependiendo de la indanona de partida utilizada. A continuación preparamos los derivados correspondientes mediante funcionalización del nitrógeno de la amina secundaria. Todas estas moléculas sintetizadas fueron evaluadas como ligandos melatoninérgicos MT1 y MT2 mediante ensayos de binding. Así se observó que el compuesto 4g era capaz de desplazar al radioligando específico para MT1 y MT2 (2-[125I]-melatonina) en el rango nanomolar (Ki MT1 = 670 nM y Ki MT2 = 190 nM). Además se pudo concluir que el compuesto 2e fue selectivo para MT1 con una Ki = 500 nM y el compuesto 2f lo fue para MT2 con un valor de Ki = 380 nM (Figura 26). Figura 26. HHIP con afinidad por los receptores MT1 y MT2 Capítulo 3. Artículo 6. “Synthesis of pyrido[2,1-a]isoquinolin-4-ones and oxazino[2,3-a]isoquinolin-4-ones: New inhibitors of mitochondrial respiratory chain” (En: European Journal of Medicinal Chemistry 2013, 69, 69) La cadena respiratoria mitocondrial (CRM) de transporte electrónico comprende cuatro complejos enzimáticos (del I al IV), el coenzima Q (ubiquinona) y el citocromo C. Este sistema juega un papel esencial en la síntesis del ATP, el metabolismo de las especies reactivas del oxígeno y la apoptosis. Por ello, sus inhibidores presentan importantes perspectivas para convertirse en nuevos agentes antitumorales. Los alcaloides benzo[a]quinolicidínicos poseen interesantes propiedades biológicas, así como una similitud estructural con algunos inhibidores de la CRM conocidos. En este trabajo decidimos realizar la síntesis de moléculas con dicho esqueleto. Entre los métodos descritos en la literatura, elegimos el de Pemberton, puesto que nos permitía explorar la reactividad de las iminas y aprovecharnos de la diversidad estructural que proporcionaba, dado que con él se obtienen pirido[2,1-a]-IQ y oxazino[2,3-a]-IQ. Las diferentes iminas se sintetizaron mediante la ciclación de Bischler-Napieralski y se hicieron reaccionar con diferentes dioxinonas. El producto mayoritario obtenido de esta reacción depende del pH del medio: en condiciones neutras, los productos mayoritariamente aislados fueron las pirido[2,1-a]-IQ mientras que al añadir una base, se formaron preferentemente las oxazino[2,3-a]-IQ. Siguiendo este procedimiento se sintetizaron tres series de compuestos, a partir de tres iminas diferentes, dando un total de 11 compuestos a ensayar como posibles inhibidores de la CRM. Figura 27. Pirido[2,1-a]-IQ y oxazino[2,3-a]-IQ inhibidoras de la CRM. En general, las oxazino[2,3-a]-IQ mostraron mayor potencia que sus respectivos análogos piridínicos. Por ejemplo: el compuesto 1b (Figura 27) mostró una CI50 de 8.33 μM mientras que su análogo oxigenado 1c presentó una capacidad de inhibición cinco veces superior. Una tendencia similar se observa en todos los productos ensayados. En cuanto al sustituyente en posición 2, un grupo fenilo mantuvo la actividad (1e) y un anillo furánico proporcionó el compuesto más activo, 1g. La desprotección de los metoxilos del anillo A (1h) también mantuvo la actividad. En el mismo sentido, cuando se introdujo un anillo aromático en posición 1 (series 2 y 3), las pirido[2,1-a]-IQ (2b, 3b) inhibieron la CRM con potencias moderadas, mientras que sus respectivos análogos oxazino[2,3-a]-IQ (2c, 3c) mostraron una mayor actividad. La presencia de un átomo de bromo sobre el anillo aromático no afectó significativamente a su actividad (ver Artículo 6). Comparando con el compuesto de referencia, rotenona (un potente inhibidor del complejo I, altamente tóxico), tanto las pirido[2,1-a]-IQ como las oxazino[2,3-a]-IQ mostraron actividad inhibidora de la CRM con potencias moderadas. Dado que la mayoría de inhibidores de la CRM con potenciales aplicaciones en terapéutica actúan en el rango alto nanomolar o bajo micromolar, estos compuestos ensayados, y especialmente las oxazino[2,3-a]-IQ, pueden considerarse inhibidores efectivos de la CRM. Artículo 7: “Synthesis of new antimicrobial pyrrolo [2,1-a]isoquinolin-3-ones” (En: Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20, 6589) Las pirrolo[2,1-a]isoquinoleínas (IQ), MSA poco frecuentes en la naturaleza, presentan una estructura original y han mostrado una cierta actividad antimicrobiana. La búsqueda de nuevos antibióticos y antifúngicos que puedan sustituir a fármacos poco eficaces, a causa de las resistencias generadas por los microorganismos, fue lo que nos impulsó a realizar la síntesis de nuevas pirrolo[2,1-a]-IQ con actividad antimicrobiana. Existen diversos métodos de síntesis de pirrolo-IQ. Nosotros hemos desarrollado un nuevo procedimiento basado en una doble ciclación intramolecular a partir de β-fenilacetamidas (Figura 28). Mediante este método, las pirrolo-IQ fueron obtenidas con buenos rendimientos. Figura 28. Mecanismo de ciclación de pirrolo[2,1-a]-IQ. Utilizando este procedimiento, realizamos la síntesis de tres series de pirrolo[2,1-a]-IQ (Figura 29). Entre ellas, se sintetizó el compuesto natural trollina (3b). Figura 29. Pirrolo[2,1-a]-IQ antimicrobianas. Los 13 compuestos sintetizados fueron evaluados como bactericidas y antifúngicos, mediante la técnica de difusión en agar. En lo que respecta a los test bactericidas, nuestros compuestos fueron ensayados frentes a diversas especies bacterianas patógenas humanas: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus,Enterococcus faecalis, Salmonella typhi, Escherichia coli y Erwinia carotovora. En general, pudimos observar que la introducción de un grupo lipofílico en posición 8 y/o 9 resultó adecuada para aumentar la actividad antimicrobiana, en comparación con los compuestos con hidroxilos libres en estas posiciones, como en el caso del compuesto 1b y de la trollina (3b) (Figura 29). El compuesto que presentó una actividad más relevante fue 2a, que posee un átomo de cloro en posición 8 y un grupo metoxilo en posición 9. Este compuesto demostró actividad bactericida frente a todas las cepas ensayadas. Además, mostró el mayor halo de inhibición frente a S. aureus y E. carotovora de entre todas las pirrolo-IQ sintetizadas. En el caso de esta última, la potencia bactericida de 2a fue equiparable a la del compuesto de referencia (tetraciclina). La actividad fungicida fue comprobada frente a algunas cepas de hongos fitopatógenos: Aspergillus parasiticus, Trichoderma viride, Fusarium culmorum, Geotrichum candidum y Phytophthora citrophthora. Dentro de la serie 1, las pirrolo-IQ más activas fueron 1a y su análogo fluorado 1e. Estos compuestos mostraron una potencia similar entre ellos, lo que sugiere que el grupo O-bencilo en posición 8 de las pirrolo-IQ contribuye positivamente a sus propiedades antifúngicas, independientemente de que contenga o no un grupo halógeno. El compuesto 2a, el más activo en los ensayos bactericidas, demostró un efecto antifúngico moderado.

Summary – Results and Discussion. In the present Thesis, we have developed several synthetic routes in order to obtain different scaffolds of isoquinolines (IQ) alkaloids and hexahydroindenopyridines (HHIP). In addition, we have made their corresponding pharmacological tests, based on results previously obtained for these compounds with synthetic and/or natural origin and other structurally similar compounds. It has been observed, throughout many years, the IQ alkaloids are one of the active secondary metabolites (ASM) most abundant and with highest pharmacological interest, isolated in species of Annonaceae family. Azafluorenones are pyridin alkaloids with antimalarial properties also present in Annonaceae, which inspired us for the synthesis of HHIP. We have developed the synthesis of these new drugs for the following biological targets: a)- IQ with affinity towards Dopaminergic Receptors D1 y D2. b)- HHIP with affinity towards Melatoninergic Receptors MT1 y MT2. c)- IQ with antimicrobial activity. d)- IQ with antitumor activity. This Thesis is composed of seven articles which have been classified in three chapters: Chapter 1: Isoquinoline Alkaloids with Affinity for Dopaminergic Receptors – Molecular Modeling on Dopaminergic Receptors: Articles 1, 2 and 3. Chapter 2: Indenopyridine Alkaloids with Affinity for Melatoninergic Receptors: Articles 4 and 5. Chapter 3: Isoquinoline Alkaloids with Antimicrobial and Antitumor Activities: Articles 6 and 7. Chapter 1 Article 1. “2,3,9- and 2,3,11- Trisubstituted tetrahydroprotoberberines as D2 dopaminergic ligands ” (in: European Journal of Medicinal Chemistry, 2013, 68, 150) Dopamine-mediated neurotransmission plays an important role in the central nervous system. A disorder in the dopaminergic system may cause neurological and psychiatric disorders as schizophrenia or Parkinson’s disease. Therefore, there is an increased interest in the discovery of novel dopaminergic ligands, with high affinity for D1 and D2 dopamine receptors (DR), as potential drugs in the therapy of these neurological disorders. Tetrahydroprotoberberines (THPB) are natural compounds which exist in different plant species as active secondary metabolites (ASM). This kind of IQ alkaloids contains several pharmacological activities including affinity for DR. In order to improve the binding affinity towards DR, a synthetic route was developed to obtain three series of THPB. Finally, we synthesized 11 molecules to assay (Figure 19). Figure 19. Series of THPB. There are different methods for synthesizing THPB. We carried out a synthetic route that consists in five steps. The first step is a Henry reaction, whereby the β-nitrostyrene is obtained. This is followed by a reduction reaction to achieve the phenylethylamine, which was treated with the corresponding acid chloride to give the corresponding phenylacetamide. Next, a Bischler-Napieralski cyclodehydration followed by the imine reduction will result in the benzyl-THIQ. This compound is the starting material to obtain our THPB of interest by means of Mannich cyclization. In the present work, we have studied the influence of A- and D-ring substituents of the THPB synthesized towards DR. It was observed that the presence of a hydroxyl group in A-ring increased the affinity for both D1 and D2 DR in comparison with blocked oxygenated function analogues. The presence of a halogen atom in the A-ring increased the affinity for D1 DR and decreased the selectivity over D2 DR. Furthermore, it was observed that the presence of a methylenedioxy group in 2 and 3-positions decreased the selectivity over D2 DR. On the other hand, it was observed that substituents in the D-ring also produced changes in the affinity for DR. The presence of a hydroxyl group in 9-position, increased the affinity for D1 and D2 DR. Among the 11 THPB tested, the most active molecule was 9f, while a hydroxyl group in the 11-position substantially decreased the affinity for both DR (Figure 20). Figure 20. Displacement curves of the specific binding of D1 and D2 DR ligands by the compounds 9e and 9f. Data were displayed as mean ± SEM for 3-5 experiments. Molecular modeling studies were carried out to better understand the interaction between the synthesized drugs and the D2 DR. These studies were performed using molecular dynamics simulations and quantum mechanical calculations of three of the most active THPB (9c, 9d and 6b). In these simulations it was concluded that the most important interactions in the drug-receptor binding are: the interaction between Asp 114 and the protonated amine with positive charge of the THPB and the interaction between Ser 193 and/or Ser 194 and catechol group of the A-ring. In addition, we observed that 9d is the drug with better interaction of the three molecules tested, since this compound has a high energy of interaction with D2 DR. Furthermore, cell toxicity assays were performed on human neutrophils by MTT and flow cytometry assays. In this study we observed that none of THPB synthesized were cytotoxic. Article 2. “Synthesis of hexahydrocyclopenta[ij]isoquinolines as a new class of a dopaminergic agents” (in: European Journal of Medicinal Chemistry, 2015, 90, 101) THIQ are natural compounds present in many plant species. The isoquinoline alkaloids were biosynthesized from tyrosine and dopamine, therefore we have been studied the affinity of these synthesized compounds towards DR. In the Article 2, we have developed the synthesis of a series of tricyclic alkaloids called 1,2,3,7,8,8a-hexahydrociclopent[ij]-isoquinolines (HCPIQ), in order to optimize and improve the affinity for D1 and D2 DR. The synthetic route of this class of compounds begins with the synthesis of the phenylacetamide by Schotten-Baumann conditions. The second step is the Bischler-Napieralski cyclodehydration to obtain the corresponding imine, which after reduction will result in the THIQ. The last step is an intramolecular cyclization by Friedel-Crafts conditions and using Eaton’s reagent to generate the cyclopentane ring (Figure 21). Reagents and conditions: (a) cynnamoyl chloride, CH2Cl2, NaOH 5 %, rt, 3h; (b) POCl3, acetonitrile, N2, refluxe, 5h; (c) NaBH4; MeOH, rt, 2h; (d) Eaton’s reagent (P2O5-CH3SO3H, 1:10 w/w), refluxe, 15h; (e) CH2Cl2, BBr3, rt, 2h; (f) methanol, formaldehyde, formic acid, refluxe, 1h, followed of NaBH4, refluxe, 1h; (g) CH3CN, K2CO3,allyl chloride, refluxe, 10h. Figure 21. Synthetic scheme of HCPIQ. It was observed that all the HCPIQ synthesized were able to displace the specific radioligands ([3H]-SCH 23390 (D1) and [3H] raclopride (D2)) from its D1 and D2 DR binding sites, respectively. As in the case of THPB, the hydroxyl group produces greater binding activity than their corresponding blocked oxygenated function analogues. The HCPIQ 3a, 3c and 3e had outstandingly affinity values for D2 DR, being 29, 13 and 18 nM respectively. In addition, it was observed in all series a very high selectivity for the D2 DR. The most selective compounds were 3a and 3c, with a ratio D1/D2 of 2465 and 1010 respectively. In this work, we also assayed cell toxicity on human neutrophils by MTT assay, and we found that HCPIQ synthesized did not show cytotoxicity. Article 3. “3-Chlorotyramine Acting as Ligand of the D2 Dopamine Receptor. Molecular Modeling, Synthesis and D2 Receptor Affinity” (in: Molecular informatics, 2014, in press) This study was carried out in three steps. Firstly, molecular dynamic simulations (MD) to evaluate the molecular interactions between the compounds and the D2 DR were performed. Secondly, a reduced model system for the binding pocket was used. Finally, the most representative complexes obtained in the previous steps were further analyzed theoretically by Density Functional Theory (DFT) calculations with the Quantum Theory of Atoms in Molecules (QTAIM) approach to the electron density distribution analysis. Figure 22. Dopamine and chlorinated analogues From the relative binding energies obtained in the MD simulations, it can be observed that the replacement of the OH group in meta respect to the aminoethyl chain by a chlorine atom (Figure 22, compound 3) increases the affinity towards D2 DR when compared with DA (1). In contrast, the replacement of the OH group in para position (2) resulted in the opposite effect. As it was earlier suggested in previous articles of Prof. Ricardo D. Enriz’s group which collaborates actively with our research group, the strong interaction with the carboxylic group of an aspartate is very important for ligand’s binding, since the interaction with the Asp 114 was maintained for all the tested complexes (Figure 23). On the other hand, Val 115 can form several interactions with the DA aromatic ring. In regard to other serine residues of the binding site, Ser 197 is the residue that exerted the largest contribution to the interaction energy for complex with 1 and 2. In addition, Ser 193 showed the most important contribution in the complex with compound 3. Finally, the residue decomposition analysis exhibited a significant contribution of Phe 389. The contribution of this residue was greater for 1/D2 DR or compound 3/D2 DR complexes than for compound 2/D2 DR complex. Figure 23. Interaction energies for compound 3. Chapter 2. Article 4. “Synthesis of new melatoninergic hexahydroindenopyridines” (in: Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24, 3534) Hexahydroindenopyridines (HHIP) are alkaloids with a novel scaffold which generates a new class of compounds with a potential utility as therapeutic agents. HHIP possess several pharmacological activities such as antispermatogenic and serotoninergic activity, among others. In order to obtain HHIP with different substitutions on important positions of this skeleton, 1-, 7-, and 8- positions, and to make an extensive study on the capacity of these compounds to bind to the melatonin receptors MT1 and MT2, the following synthetic route was developed (Figure 24). Reagents and conditions: (a) piperidine, TiCl4, dry toluene, N2, rt, 3 days; (b) 3-bromopropylamine hydrobromide, dry DMF, 110 ºC, 8 h; (c) NaBH4, EtOH, rt, 16 h. Figure 24. Synthetic route for synthesis of HHIP 1b and 2b. Therefore, the commercially available 1-indanone substituted in 5- and/or 6- position was the starting material which was treated by catalytic reaction with TiCl4 and pyridine to obtain the corresponding enamine. This was subjected to a cyclization by reaction with 3-bromo-propylamine hydrobromide followed of a reduction reaction with sodium borohydride to give the HHIP scaffold. Then, we made a functionalization of the nitrogen atom in the HHIP to obtain the compounds capable of mimicking melatonin’s behavior on its receptors. Thus, we synthesized N-acetylated, carbamates and N-alkylated derivatives by classical conditions. Preliminary melatoninergic binding affinity studies of synthesized HHIP showed that the appropriately functionalized skeleton is a pharmacophore with capacity to bind to melatonin receptors MT1 and/or MT2, which could provide new sleep-inducing agents. Article 4. “Efficient synthesis of hexahydroindenopyridines and their potencial as melatoninergic ligands” (in: European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 86, 700) Melatonin is a neurohormone involved in cell, neuroendocrine and neurophysiological processes. It has been observed that alterations in melatoninergic system can produce diseases such as insomnia or depression. Thus, research in this field aims at creating new drugs with a high affinity for melatonin receptors (MT). Hexahydroindenopyridines (HHIP) are tricyclic alkaloids with structure related to melatonin and with other marketed drugs such as Agomelatine (Valdoxan®) used in insomnia. For this reason, our group paid attention to obtain the HHIP compounds with a high affinity for the MT receptors (Figure 25). Figure 25. Melatonin, Agomelatine and HHIP. In this article, we synthesized 25 HHIP, classified into four series, with a different substitution at the 7- and 8-position (A-ring), according to the indanona used as starting material. Then, we prepare the corresponding derivatives by functionalization of nitrogen atom of the secondary amine. All synthesized molecules were evaluated as MT1 and MT2 melatoninergic ligands by binding assays. Thus, we can observe that compound 4g was able to displace the specific radioligand to MT1 and MT2 (2-[125I]-melatonin) in the nanomolar range (Ki MT1 = 670 nM and Ki MT2 = 190). Furthermore, it was concluded that compound 2e was selective for MT1 (Ki MT1 = 500 nM) and compound 2f was selective for MT2 (Ki MT2 = 380 nM) (Figure 26). Figure 26. HHIP with affinity for MT1 and MT2 receptors. Chapter 3. Article 6. “Synthesis of pyrido[2,1-a]isoquinolin-4-ones and oxazino[2,3-a]isoquinolin-4-ones: New inhibitors of mitocondrial respiratory chain” (in: European Journal of Medicinal Chemistry 2013, 69, 69) Mitochondrial electron transport chain comprises the enzymatic respiratory complexes (I-IV), the coenzyme Q (ubiquinone) and cytochrome c. Mitochondria play essential roles in the ATP synthesis, ROS metabolism and apoptosis. It is important that cells preserve an appropriate level of intracellular ROS to keep redox balance and signaling cellular proliferation. Some anticancer agents have the ability to inhibit mitochondrial electron transport and/or increase superoxide radical generation in tumor cells, resulting in cell apoptosis through ATP levels reduction and/or cell-damaging. Benzo[a]quinolizidine is an important heterocyclic framework that can be found in numerous bioactive compounds. Benzo[a]quinolizidines are structurally related to some mitochondrial respiratory chain (MRC) inhibitors (mycotoxins, such as circumdatins) and we have carried out their synthesis as target of this study. Among the different depicted approaches, we have applied the Pemberton’s method that uses dioxins as acyl-ketenes precursors. Therefore, taking advantage of the chemical diversity generated by this procedure, different pyrido[2,1-a]isoquinolines and oxazino[2,3-a]isoquinolines were obtained. Several imines were prepared using Bischler-Napieralski cyclization and then reacted with dioxinones. The major product obtained relied on the pH of the medium. Under neutral conditions, the formation of pyridones was clearly favored, and under basic conditions oxazinones were preferentially formed. Following this procedure, we synthesized three series of compounds, starting from the three different imines to get a total of 11 compounds. Then, their potential effect on respiratory chain inhibition was evaluated. Figure 27. Pyrido[2,1-a]- and oxazino [2,3-a]-IQ MRC inhibitors. In general, oxazino[2,3-a]-IQ-4-ones seemed to display greater activity than their respective pyrido[2,1-a]-IQ-4-ones analogues. For instance, while compound 1c (Figure 27) IC50 was 1.36 μM, its pyridine analogue (1b) showed a decrease NADH oxidase activity (IC50 = 8.33 μM). By contrast, the size and nature of the substituent at 2-position of the oxazine did not seem to affect NADH oxidase activity. In this regard, not only the existence of a phenyl group (1e) kept the activity but the presence of a furan ring at C2 position provided the most potent compound 1g. Moreover, the deprotection of the methoxyl groups in the A ring to obtain a catechol 1h, maintained the activity. On the other hand, when the aromatic ring was placed on C1 position (series 2 and 3), the pyrido- and oxazino-IQ-4-ones were able to inhibit respiratory chain without any noticeable influence of the halogen group. Compared with the highly toxic compound, rotenone (a high-affinity inhibitor of complex I), the pyridine and oxazinone derivatives showed a moderated inhibitory activity. Given that most of the respiratory chain inhibitors with potential therapeutic interest act in the high nanomolar and low micromolar ranges, these compounds and especially the oxazinone derivatives, can be considered effective inhibitors of the whole respiratory chain. Article 7: “Synthesis of new antimicrobial pyrrolo [2,1-a]isoquinolin-3-ones” (in: Bioorganic & Medicinal Chemistry 2012, 20, 6589) Pyrroloisoquinolines are secondary active metabolites scarce in nature, which present an original structure with certain antimicrobial properties. Inasmuch, the discovery of new antimicrobial agents has turned into a clear need in the last few years, due to the development of resistance to classic drugs as a consequence of their extensive use. Althought several methods have been employed for the synthesis of these compounds, we have applied a new methodology based on double intramolecular cyclization, conducted by Bischler-Napieralski cyclodehydration from an ester phenylethylamide. It involves the subsequent reduction of the imine intermediate (Figure 28). Figure 28. Mechanism of cyclization of pyrrolo[2,1-a]isoquinolines. Using this method we performed the synthesis of three series of compounds with pyrroloisoquinoline structure, obtaining a total of 13 different molecules (Figure 29). The natural product trolline (3b) was synthesized, among other compounds. Figure 29. Antimicrobial pyrrolo[2,1-a]isoquinolines   All the synthesized pyrrolo[2,1-a]isoquinolines were assayed in vitro for their ability to inhibit bacterial and fungal growth. In the antimicrobials assays, our compounds were tested against several human pathogenic bacteria as well as economically important phytopathogenic bacteria and/or fungi. The bacterial agents were: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Salmonella typhi, Escherichia coli and Erwinia carotovora In general, a lipophilic group at the 8- and/or 9- position seemed to provide moderate activity compared with that displayed by a free hydroxyl group such as 1b and trolline (3b) (Figure 29). The most noteworthy compound was 2a, which possessed both a chlorine atom and a methoxyl group at the 8- and 9- position, respectively. This compound exerted bactericidal activity against all tested strains. Furthermore, 2a showed a potency within the range displayed by the reference compound tetracycline. Fungicide activity was tested against some phytopathogen fungi strains: Aspergillus parasiticus, Trichoderma viride, Fusarium culmorum, Geotrichum candidum and Phytophthora citrophthora. Compounds 1a, 2a, 1c and 1e inhibited fungal growth in vitro. In series 1, the most active compounds were 1a and its fluorinated analogue 1e, which showed similar potency. Consequently, it seems that the benzylic moiety located at the 8-position on the pyrroloisoquinoline structure contributed positively to its antifungal properties regardless the presence of a halogen atom. By contrast, compound 2a, which was the most potent bactericidal agent against human pathogens, only exerted a moderated antifungal activity. Therefore, 8-chloro-9-mtehoxy compound (2a) was the most relevant in bactericidal assays and 8-benzyl-pyrroloisoquinolines 1a and 1e in the fungicidal assays.