Las plantas sufren las infecciones causadas por muchos patógenos como hongos, bacterias, virus y nematodos. Las infecciones virales son persistentes y frecuentemente no se curan por el sistema inmune como en los animales. Existe una alta gama de virus de plantas, alrededor de 450 especies bien caracterizadas, que cusan una alta gama de enfermedades en plantas. Enfrentando esta situación, las planas no son meros sujetos pasivos, sino que han desarrollado mecanismos defensivos elaborados y efectivos para prevenir, o limitar, los daños causados a las infecciones virales. Entre estos mecanismos de defensa, las plantas tienen genes que confieren resistencia a virios patógenos, incluyendo los virus. Estos sistemas defensivos incluyen importantes genes únicos de resistencia que inducen la respuesta hipersensible, uno o más genes que previenen la replicación viral, el movimiento célula a célula o sistémico, y rutas de resistencia más generales como el silenciamiento por RNA. Actualmente, la biotecnología puede usarse para producir cultivos resistentes a virus. De hecho, es posible conferir resistencia transgénica a los cultivos mediante la expresión de un gen de resistencia encontrado de forma natural en una especie de planta alternativa. Un primer método biotecnológico para inducir resistencia a un virus determinado fue la transformación de la planta con el gen que codifica la CP del virus. Otra forma natural que las plantas tienen para luchar contra las infecciones virales es el silenciamiento por RNA. Este mecanismo defensivo es una importante ruta celular para la defensa contra ácidos nucleicos exógenos, incluyendo los virus. En este trabajo hemos investigado algunos temas relacionados con las plantas resistentes al virus del mosaico del nabo (TuMV) como consecuencia de la expresión transgénica de microRNAs (amiRs) artificiales. Los microRNAs (miRs) son pequeños RNAs (21-24 nt) que se encuentran en las células eucariotas y actúan como reguladores postranscripcionales de la expresión génica. Su papel es guiar al complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) para cortar la secuencia complementaria correspondiente. Es posible rediseñar la secuencia del miR para reconocer un transcrito diferente utilizando distintos precursores de miRs (pre-miRs). En nuestro caso, el pre-miR utilizado como precursor ha sido el pre-miR159a de Arabidopsis thaliana, y se ingenierizó para reconocer una secuencia específica de 21 nt del cistrón HC-Pro del TuMV. La expresión transgénica de estos amiRs en plantas de A. thaliana resultó en una resistencia completa y específica contra el TuMV. De forma similar, el mecanismo de silenciamiento génico (RNAi) se ha utilizado en ensayos in vitro como estrategia antiviral para inhibir la replicación de virus de humanos, tales como el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1), el virus C de la hepatitis (HCV) o el virus A de la gripe. En todos estos experimentos se expresó un solo amiR, y así, la resistencia dependía exclusivamente del apareamiento entre este amiR y la secuencia viral correspondiente. Una cuestión importante contra estas estrategias antivirales basadas en amiRs ha sido la emergencia de variantes virales resistentes. Estas variantes se diferencian del virus silvestre (WT) en al menos una mutación puntual en la diana de 21 nt, provocando el reconocimiento imperfecto con el correspondiente amiR y, consecuentemente, el procesamiento ineficiente o inefectivo por parte de RISC. Aunque la maquinaria de RNAi tolera cambios en algunas de las posiciones de la diana de 21 nt, es sensible a cambios en otras, particularmente en el centro de la diana. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que algunos cambios en la secuencia diana de 21 nt generan variantes virales de escape. Hasta ahora, la aparición de variantes de escape se observó en cultivos celulares. Un ambiente tan homogéneo favorece la multiplicación, colonización y, en definitiva, la evolución viral. Las plantas de A. thaliana transgénicas que son resistentes al TuMV se seleccionaron para ensayar la durabilidad de la resistencia conferida por los amiRs in vivo. De hecho, la inoculación y seguimiento de la infección viral en plantas enteras representa una diferencia importante con los cultivos celulares in vitro, lo que probablemente tendrá un gran imparto en la evolución viral. Así, este trabajo tuvo como objetivo el seguimiento de la posibilidad que el TuMV evolucione y genere mutantes de escape capaces de romper la resistencia mediada por el amiR. En otras palabras, evaluar la viabilidad de las terapias antivirales basadas en la expresión transgénica de amiRs en plantas. Es esencial entender como de probables son las poblaciones virales que contienen variantes de escape, que pueden ser seguidamente transmitidas a las plantas inmunes. Para conseguirlo, usamos dos líneas de plantas de A. thaliana transgénicas: la línea 12-4 que muestra total resistencia al virus y la línea 10-4, con resistencia parcial a la infección por TuMV. En un primer experimento, evolucionamos el TuMV en diferentes contextos, plantas silvestres o la línea 10-4. Regularmente, las plantas 12-4 completamente resistentes se desafiaron con las poblaciones virales evolucionadas. Al final del experimento, todos los linajes virales evolucionados independientemente fueron capaces de producir mutantes de escape. De forma remarcable, evaluamos la fuerza selectiva cuando el virus evoluciono en un contexto subinhibitorio y encontramos una aceleración en la emergencia de mutantes de escape. La principal característica de estas variantes es siempre al menos una mutación en la región diana de 21 nt del amiR, principalmente en dos posiciones críticas en el centro. En principio, estos resultados restan interés a la tecnología de resistencia basada en amiRs. Entonces, ¿cómo podemos mejorarla para producir una resistencia más perdurable? En un segundo experimento, la variabilidad natural del TuMV se contrastó entre 100 aislados de campo. El análisis filogenético de estas secuencias reveló dos puntos importantes. Primero, la región de HC-Pro reconocida por el amiR utilizado en el primer experimento tiene una gran variabilidad genética a lo largo de los 21 nt, mientras que otras regiones en la CP no muestran ninguna variabilidad entre los 100 aislados. Con esta información, se produjo una segunda generación de plantas transgénicas que expresaban dos amiRs específicos contra la región conservada de CP. En resumen, las nuevas plantas doblemente transgénicas de A. thaliana mostraron una resistencia mayor y más duradera al TuMV. Estos resultados prometen una durabilidad considerable en el campo. En nuestro último experimento, evaluamos el potencial para evolucionar de supresores de silenciamiento virales (VSR) en el genoma del TuMV. Con la inserción de un nuevo cistrón que codifica la VSR del virus del mosaico del pepino (CMV) en el genoma del TuMV, creamos un TuMV que lleva una redundancia funcional. Tras la evolución mediante pases seriados, las modificaciones que se encontraron en HC-Pro y en el segundo VSR fueron solo mutaciones puntuales. El mensaje general de estos resultados es que la recombinación entre el TuMV y otro virus puede resultar en quimeras estables. La adición de un segundo VSR, que puede también ser una proteína multifuncional, puede conferir al virus quimérico varias ventajas para colonizar la planta. Existen varias ventajas asociadas al uso de la estrategia de los amiRs. En contraste con otras biotecnologías, solo se requiere un pequeño RNA (21 nt), cuya secuencia se puede elegir para reducir efectos colaterales en el genoma de la planta. La estrategia de los amiRs también minimiza los riesgos potenciales en bioseguridad, reduciendo cualquier posible impacto negativo sobre el medio ambiente. Finalmente, se puede conseguir una resistencia de amplio espectro a varios virus mediante la coexpresión de múltiples amiRs adecuadamente diseñados. Este trabajo trae la visión de la biología evolutiva a los amiRs, remarcando algunas decisiones críticas que se tienen que tener en cuenta para diseñar resistencias perdurables.

Plants suffer from the infections caused by many pathogens such as fungi, bacteria, viruses, and nematodes. Virus infections are persistent and frequently are not cleared up by the immune system as in animals. It exist a large variety of plant viruses, around 450 well-characterized species, which cause a high range of diseases in plants. Facing this situation, plants are not merely passive subjects, but they had developed elaborate and effective defense mechanisms to prevent, or limit, damages due to viral infections. Among these defense mechanism, plants have genes that confer resistance to various pathogens, including viruses. These defense systems include single, major resistance genes that induce hypersensitive response, one or more genes that prevents virus replication, cell-to-cell or systemic movement, and a more general resistance pathway called RNA silencing. Nowadays, biotechnology can be used to produce virus-resistant crops. Indeed, it is possible to confer transgenic resistance to crops by expressing a resistance gene naturally found in a different plant species. One first biotechnological method to induce resistance to a given virus was by transforming a plant with the gene encoding the virus coat protein (CP). Another natural way plants have to fight virus infection is RNA silencing. This defense mechanism is an important cellular pathway for defense against foreign nucleic acids, including viruses. In this work we have researched several questions around plants resistant to Turnip mosaic virus (TuMV) as a consequence of the transgenic expression of artificial microRNAs (amiRs). MicroRNAs (miRs) are short RNAs (21-24 nt) found in eukaryotic cells and act as post-transcriptional regulators of gene expression. Their role is to guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to cleave the corresponding complementary sequence. It is possible to redesign the miR sequence to target different transcripts using different pre-miRs as backbones. In our case, the pre-miR used as backbone has been the pre-miR159a precursor from Arabidopsis thaliana, and it was engineered to target a 21 nt specific sequence of TuMV HC-Pro cistron. Transgenic expression of these amiRs in A. thaliana plants resulted in a complete and specific resistance against TuMV. Similarly, the gene silencing mechanism (RNAi) has been used in in vitro assays antiviral strategies to inhibit the replication of human viruses, such as Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), Hepatitis C virus (HCV) and Influenza A virus. In all these experiments, a single amiR was expressed, and thus, resistance strictly depended on the match between this amiR and the corresponding viral sequence. A major issue confronting these amiR-based antiviral strategies has been the emergence of resistant virus variants. These variants differ from the wild-type (WT) virus by at least one point mutation in the 21 nt target, leading to imperfect matching with the corresponding amiR and hence to inefficient or ineffective processing by RISC. Although the RNAi machinery tolerates changes in some positions of the 21 nt target, it is sensitive to changes in some others, particularly at the center of the target site. Taken together, these results suggested that some changes in the 21 nt target sequence generate virus escape variants. Until now, apparition of escape variant was observed in cell culture. Such homogeneous environment favors multiplication, colonization and so evolution of the virus. Transgenic A. thaliana plants resistant to TuMV have been chosen to test the durability of the resistance conferred by the amiRs in vivo. Indeed, inoculating and following virus infection in whole plants represent a major difference to in vitro cell cultures, thus likely having a large impact in virus evolution. This work thus aimed at tracking the likelihood of TuMV to evolve and generate escape mutants able to breakdown the amiR-mediated resistance. In other words, to evaluate the viability of antiviral therapies based on the transgenic expression of amiRs in plants. It is essential to understand how likely are viral populations to contain escape variants, which may be subsequently transmitted to immunized plants. To do so, we used two lines of A. thaliana transgenic plants: the 12-4 line which shows total resistance to the virus and the 10-4 line, with partial resistance to TuMV infection. In a first experiment, we evolved TuMV in different contexts, wild-type plants or the 10-4 line. Regularly, fully resistant 12-4 plants were challenged with the evolved viral populations on the. At the end of the experiment, all independent viral evolved linages were able to produce escape mutant. We notably evaluate the selective force when the virus evolved in a subinhibitory context and we found acceleration in the emergence of escape mutant. The major characteristic of these variants is always at least one mutation in the 21-nt amiRs target region, mainly at two critical positions at the center. At face value, these results rest interest to the amiR-based resistance technology. Then, how can we improve it to produce a more durable resistance? In a second experiment, the natural variability of TuMV was overviewed among 100 field isolates. The phylogenetic analysis of these sequences revealed two major points. First, the HC-Pro region targeted by the amiR used in the first experiment has a high genetic variability along its 21 nt, whereas other regions at the CP show no variability at all among the 100 isolates. With this information, a second generation of transgenic plants was produced expressing two amiRs specific to the CP conserved region. In short, the new double transgenic A. thaliana plants showed high and more durable resistance to TuMV. Results promise a considerable durability in field. In our last experiment, we evaluate the potential for evolution of viral suppressors of RNA silencing (VSR) in TuMV genome. With the addition of a new cistron coding for Cucumber mosaic virus (CMV) VSR into TuMV genome, we created a TuMV carrying functional redundancy. After evolution by serial passages, the modification encountered in the HC-Pro and the second VSR were only punctual mutations. The general message of these results is that recombination between TuMV and another virus can result in stable chimeras. The addition of a second VSR, which can also be a possible multifunctional protein, may give the chimeric virus several advantages to colonize the host plant. There are several advantages associated to the use of the amiR strategy. Unlike in other biotechnologies, only one stable small RNA (21 nt) is required, whose sequence can be chosen to reduce off-target effects in plants genome. The amiR strategy also minimizes potential risks for bio-safety concern, reducing any possible negative environmental impact. Finally, broad-spectrum resistance to several viruses can also be achieved by co-expression of appropriately designed multiple amiRs. This work brings an evolutionary biology vision to the amiRs, indicating several critical choices that have to be made for designing durable resistances.