Efecto de la pregabalina sobre la expresión de Fos en el tronco del encéfalo y la médula espinal en dos modelos de dolor neuropático
NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Efecto de la pregabalina sobre la expresión de Fos en el tronco del encéfalo y la médula espinal en dos modelos de dolor neuropático

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Efecto de la pregabalina sobre la expresión de Fos en el tronco del encéfalo y la médula espinal en dos modelos de dolor neuropático

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dc.contributor.advisor Valverde Navarro, Alfonso A.
dc.contributor.advisor Martínez Soriano, Francisco
dc.contributor.advisor De Andrés Ibáñez, José
dc.contributor.author Villanueva Pérez, Vicente Luis
dc.contributor.other Departament d'Anatomia i Embriologia Humana es_ES
dc.date.accessioned 2013-10-29T11:43:13Z
dc.date.available 2013-11-29T07:10:02Z
dc.date.issued 2012
dc.date.submitted 24-05-2013 es_ES
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10550/30444
dc.description.abstract En las últimas décadas, se han producido avances muy significativos en la búsqueda y hallazgo de nuevas estrategias terapéuticas contra el dolor. Esto ha sido posible gracias, en gran medida, al mayor conocimiento de los mecanismos subyacentes al dolor. Particularmente sustanciales han sido los datos obtenidos acerca del sustrato anatómico de la transmisión dolorosa y de su modulación endógena. En base a estos datos de carácter anatómico se ha ido clasificando el dolor en diferentes tipos: el dolor neuropático, cuando el origen del dolor está en el propio sistema nervioso, y el no-neuropático, cuando el origen del mismo se sitúa en estructuras anatómicas no neurales, como la piel, (el dolor nociceptivo superficial), estructuras del sistema musculoesquelético, (el dolor nociceptivo profundo), o como los órganos internos, (el dolor visceral). Sin embargo, los avances referidos no se reparten por igual entre todos los tipos de dolor mencionados. La respuesta del dolor neuropático al tratamiento con analgésicos comunes, o en muchas ocasiones incluso con opiáceos, todavía dista de ser satisfactoria. La falta de respuesta del dolor neuropático al tratamiento con analgésicos comunes, o en muchas ocasiones incluso a los opiáceos, ha llevado a los terapeutas a dirigir su mirada hacia otras soluciones farmacológicas. De entre todas las propuestas, actualmente una de las que se está reivindicando cada vez con mayor fuerza es el uso de fármacos antiepilépticos, que están demostrando ser una alternativa válida al tratamiento del dolor neuropático (McQuay et al., 1995). El mecanismo de acción de estos fármacos anticonvulsivantes es diferente al de los analgésicos tradicionales: mientras estos últimos reducen las señales aferentes procedentes tanto de de tejido sano como lesionado, los fármacos antiepilépticos podríamos denominarlos más bien antihiperalgésicos que antinociceptivos, ya que no tienen un efecto per se sobre la nocicepción sino que reducen la hiperexcitabilidad de las neuronas del asta posterior inducida por el daño tisular. Uno de los fármacos antiepilépticos que primero se probaron en el tratamiento del dolor neuropático fue la gabapentina (Dirks et al., 2002; Turan et al., 2004). En la actualidad, sin embargo, este fármaco está siendo sustituido por nuevos derivados con el fin de aumentar su eficacia y reducir sus efectos adversos, entre los que destaca la pregabalina. La pregabalina es el enantiómero S farmacológicamente activo del ácido 3-aminometil-5-metil-hexanoico, que es similar a su predecesor la gabapentina. Su mecanismo de acción no es conocido todavía con exactitud. Varios son los mecanismos celulares que se han propuesto para explicar su efecto en el tratamiento del dolor neuropático: actuar sobre receptores NMDA, canales de calcio, canales de sodio, vías monoaminérgicas, sistemas opioides y no opioides,… A pesar de su nombre y del de su molécula predecesora, la gabapentina, no tiene acción directa gabaérgica, ni bloquea la recaptación de GABA ni su metabolismo. La pregabalina, al igual que la gabapentina, se une a la subunidad proteica alfa2-delta de los canales de calcio voltaje-dependientes, lo que podría explicar su efecto antihiperalgésico (Schwarz et al., 2005). La pregabalina ha demostrado actividad antialodínica y antihiperalgésica en varios modelos de dolor neuropático en roedores (Lauria-Horner y Pohl, 2003; Field et al., 1999; Chen y Pan, 2001), observándose estos efectos con dosis de 2 á 4 veces inferiores a las de gabapentina. Además presenta una tolerabilidad mayor que con otros anticonvulsivantes, incluida la gabapentina, lo que la consolida como una opción terapéutica muy válida en el tratamiento de estos pacientes. Los acontecimientos adversos más frecuentes son: mareos, somnolencia, edemas periféricos, cefalea, visión borrosa y estreñimiento, siendo todos ellos habitualmente de intensidad leve a moderada. Aunque la pregabalina se ha empleado en diferentes tipos de dolor neuropático como la neuralgia post-herpética (Dworkin et al., 2003; Sabatowski et al., 2004), actualmente su interés se centra en su eficacia en el dolor post-quirúrgico (Dahl et al., 2004). De hecho, el dolor post-quirúrgico puede ser considerado como un tipo de dolor neuropático que podríamos considerar transitorio o reversible. Estudios preclínicos han demostrado que la incisión quirúrgica en la pata de la rata es seguida por una hiperalgesia térmica y mecánica prolongada, como expresión clínica de una sensibilización central (Whiteside et al., 2004). Estos datos ponen de manifiesto que la sensibilización del asta posterior de la médula, aunque será reversible en la mayoría de pacientes quirúrgicos, puede ser un mecanismo algésico importante en los primeros días o semanas post-intervención. Los fármacos antihiperalgésicos, como la pregabalina, se convierten de este modo en analgésicos post-quirúrgicos atractivos porque ofrecen la posibilidad de bloquear el dolor patológico, mientras que permitirían el dolor fisiológico, que sería de utilidad por su función protectora y de alerta. Asimismo, la acción de la pregabalina sería de interés en el dolor post-quirúrgico si tenemos en cuenta que el mecanismo de acción de estos fármacos anticonvulsivantes difiere por completo del de los opiáceos, por lo que evita la disminución de la motilidad intestinal, uno de los principales efectos adversos de los opioides en los pacientes post-quirúrgicos (Field et al., 1997). Estos datos experimentales han sido corroborados en el único ensayo clínico doble-ciego, controlado con placebo, en dolor postquirúrgico dental, y donde los resultados mostraron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo tratado con 300 mg de pregabalina y el grupo tratado con placebo (Hill et al., 2001). A pesar de los estudios experimentales en animales con la pregabalina (Field et al., 1999; Eutamene et al., 2000, Hurley et al., 2002) y ensayos clínicos en humanos que avalan el uso clínico de esta sustancia en dolor neuropático, no hemos encontrado ningún trabajo que profundice en el sustrato anatómico en el que subyace a nivel del sistema nervioso central el efecto analgésico de esta sustancia antiepiléptica. El único trabajo que hemos encontrado que estudia el efecto que la administración de una de estas sustancias anticonvulsivantes, en concreto la gabapentina, tiene sobre la expresión del protooncogen c-fos a nivel de sistema nervisos central, se limita a la médula espinal dejando fuera del estudio niveles supraespinales (Kaneko et al., 2000). Nuestra revisión bibliográfica sobre el tema no ha ofrecido ni un solo trabajo en el que se pretenda identificar las estructuras neurales supraespinales que se activan o al menos se ven alteradas tras la administración de pregabalina en animales sanos, o con diferentes tipos de dolor neuropático. Parece, sin embargo, que la identificación de los centros troncoencefálicos que ven alterada su actividad neuronal por la administración de estas sustancias, sería de gran utilidad para una mejor compresión de sus mecanismos de acción, lo que permitiría mejorar su eficacia tanto empleado de forma individual como en posibles combinaciones con otros fármacos analgésicos. OBJETIVO Identificar los centros troncoencefálicos implicados en el circuito de modulación del dolor, en los que la administración de pregabalina provoque cambios significativos de actividad neuronal. El interés de alcanzar los objetivos propuestos radica en que los estudios clínicos demuestran que la pregabalina tiene un efecto analgésico en aquellos procesos en los que aparece dolor neuropático. Sin embargo, desconocemos los centros nerviosos a través de los cuales ejerce dicha acción antihiperalgésica. Los analgésicos tradicionales ejercen sus efectos a través de modular la actividad neuronal de los diferentes centros troncoencefálicos integrados en el denominado circuito endógeno de control del dolor. Para utilizar de forma más segura y eficaz estos nuevos fármacos es importante identificar los centros neurales cuya actividad, medida en forma de cambios en la expresión del protooncogén c-fos en el núcleo de sus células (Harris, 1998), cambia tras la administración de dichas sustancias. La realización del estudio en diferentes condiciones de estimulación algésica nos permitiría, además, conocer hasta qué punto la sustancia objeto de estudio, la pregabalina, puede bloquear a nivel del asta posterior de la médula la expresión de Fos debida a la llegada a ese nivel de las aferencias primarias dolorosas . MATERIAL Y MÉTODOS La metodología que emplearemos para desarrollar y alcanzar los objetivos planteados en este proyecto se basan en la detección mediante técnicas inmunocitoquímicas de las neuronas que expresan Fos en los centros troncoencefálicos implicados en el circuito de control del dolor, en los diferentes supuestos experimentales, así como en el asta posterior del segmento lumbar de la médula espinal. De forma más detallada el proceder experimental sería el siguiente: A) ANIMAL DE EXPERIMENTACIÓN El presente trabajo se llevará a cabo en 50 ratas albinas de la cepa Sprague-Dawley, machos, de peso aproximado de 250 g. Los animales serán mantenidos bajo condiciones estándar de laboratorio durante al menos una semana antes del comienzo de la experimentación: ciclos de 12 horas luz/12 horas oscuridad (la luz se enciende a las 8:00 a.m. y se apaga a las 8:00 p.m.), temperatura (15ºC) y humedad constantes, dieta estándar y libre acceso a la comida y el agua. B) GRUPOS EXPERIMENTALES Los animales se distribuirán en los siguientes grupos experimentales: B.1) Grupo Control Fisiológico (CFS) (n=10): Los animales de este grupo serán acostumbrados a las maniobras de manipulación que posteriormente pudieran ser necesarias durante el experimento. Estas manipulaciones serán las siguientes: - Sacar de la jaula al animal y pesarlo. - Inmovilizar al animal, durante 5 segundos, abrazándolo con una mano por debajo de las patas delanteras, al tiempo que se le cruzaban en aspa por delante de la cara, y con la otra sujetándole de la cola. Esta maniobra de inmovilización se le practicará dos veces a cada animal: la primera al terminar de pesarlo, y la segunda media hora después. Durante la primera inmovilización se inyecta intraperitonealmente (i.p.) 1 ml de suero salino. Entre una inmovilización y otra los animales permanecerán en sus respectivas jaulas. Los animales se sacrificarán a las 2 horas y media de la inyección i.p. de suero salino, es decir, a las 2 horas de la segunda inmovilización. La finalidad de este grupo es descartar que ni el estrés por la inmovilización, ni el posible dolor derivado de la inyección i.p., ni tan siquiera la distensión abdominal por la introducción de un volumen de 1 ml i.p., dé un patrón de expresión de Fos que pudiera enmascarar la expresión de Fos inducida por el estímulo aplicado, ya fuera éste analgésico o doloroso. B.2) Grupo Control Simulado Neuropático (CSN) (n=10): Similar al grupo CSF, con la salvedad de que una semana antes se le realizarán a los animales de este grupo todas las maniobras quirúrgicas necesarias para conseguir la exposición del nervio ciático, de forma que pueda ser comparable al grupo al que se le aplicará el test de la constricción mantenida del nervio ciático (Taber et al., 1969), pero evitando lesionarlo. La finalidad de este grupo es descartar que tampoco las maniobras quirúrgicas necesarias para poder aplicar el modelo de dolor neuropático propuesto por Taber et al. (1969) enmascararán la expresión de Fos inducida por la constricción del nervio. B.3) Grupo Control Pregabalina (CPG) (n=10): Las ratas de este grupo reciben, el día del experimento, una inyección i.p. de 1 ml, correspondiente a una dosis de morfina de 30 mg/kg (Eutamene et al., 2000) durante la primera inmovilización, 2 horas y media antes del sacrificio. B.4) Grupo Control Dolor Neuropático (CDN) (n=10): Similar al grupo CSN, pero con la diferencia de que los animales de este grupo sí reciben un estímulo doloroso neuropático por constricción del nervio ciático. Como ya se comentó anteriormente, el modelo de dolor neuropático elegido en este proyecto es el propuesto por Taber et al. (1969), que consiste en provocar una constricción mantenida del nervio ciático. Se realiza mediante 4 ligaduras separadas 1 mm entre sí en el tronco del nervio ciático a la altura del bíceps femoral, con una seda de 4-0. Los animales son sacrificados a la semana de la intervención. B.5) Grupo Pregabalina + Dolor Neuropático (PGDN) (n=10): Los animales de estos grupos reciben un estímulo doloroso neuropático y, a partir del día siguiente, 1 ml de analgésico i.p. diario durante una semana, transcurrida la cual son sacrificados. La manipulación de los animales se hará siguiendo las recomendaciones del Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valencia, así como las propuestas por Zimmermann (1983) para la investigación sobre dolor experimental en animales conscientes. C) ANESTESIA Y PERFUSIÓN Los animales fueron sacrificados con una sobredosis i.p. de pentobarbital (120 mg/kg), comenzándose con las maniobras propias del proceso de perfusión una vez se comprobaba que el animal estaba profundamente anestesiado (ausencia de reflejo corneal), y con el corazón todavía latiendo. Todo el proceso de anestesia y perfusión en ningún caso sobrepasó los 15 minutos de duración, para evitar la indución iatrogénica de c-fos por efecto de la manipulación o de la propia anestesia (Herdegen y cols., 1991; Takayama y cols., 1994). La perfusión se inició en todos los casos con un lavado del árbol vascular con 100-200 ml de suero salino isotónico heparinizado (15.000 UI/litro), para, seguidamente introducir la solución fijadora formada por tampón fosfato y paraformaldehído al 4%. Finalizado el proceso de perfusión, los animales fueron decapitados, y se procedió al descalote y extracción del cerebro, así como de la porción lumbar de la médula espinal. D) OBTENCIÓN DE LOS CORTES Las piezas se conservan a 4ºC en la misma solución fijadora hasta el día siguiente. Transcurrido ese tiempo, se pasan a una solución crioprotectora con sacarosa al 30%, en la cual permanecen 24 horas. Una vez crioprotegidas, las piezas son congeladas y seccionadas con un criostato en cortes coronales de 40 μm de grosor. E) REVELADO INMUNOCITOQUÍMICO DEL PROTO-ONCOGÉN C-FOS Tras tres lavados con PBS para eliminar la sacarosa, se procede a la detección inmunocitoquímica de la proteína codificada por el proto-oncogén objeto de nuestro estudio, c-fos, por el método del ABC (Hsu y cols., 1981). Los cortes pasan por sucesivas soluciones (Valverde-Navarro y cols., 1996). Montaje de los cortes: Los cortes se montan sobre portas gelatinizados con una solución de gelatina al 0,5% y alumbre de cromo al 0,05%. Se dejan secar durante toda la noche a temperatura ambiente, y al día siguiente, son deshidratados en diluciones crecientes de etanol (70º, 96º y 100º, Panreac), aclarados con xilol y cubiertos con Merckoglas. F) SELECCIÓN DE LOS NIVELES DE ESTUDIO Los niveles correspondientes tanto a la médula lumbar como al tronco de encéfalo son seleccionados con ayuda del atlas de Paxinos y Watson (2005). Se seleccionan al menos 2 cortes por cada uno de los niveles escogidos (Murphy y cols., 1995). G) OBTENCIÓN DE LOS PATRONES DE DISTRIBUCIÓN DE LAS NEURONAS FOS-POSITIVAS El patrón de distribución de las células inmurreactivas frente a Fos se obtienen a partir de dibujos en los que se puntean manualmente las neuronas Fos-positivas con ayuda de una cámara clara Zeiss acoplada a un microscopio Axioskopp de Zeiss con un objetivo de 20x. Dichos dibujos son elaborados por un experimentador desconocedor del grupo experimental al que pertenecen las preparaciones al puntearlas. H) OBTENCIÓN DE IMÁGENES DIGITALIZADAS DE LAS PREPARACIONES Las imágenes para el estudio fotográfico se capturan mediante una cámara de vídeo NIKON (Dxm 1200) acoplada un microscopio Nikon Eclipse e600 con luz directa. I) ANÁLISIS ESTADÍSTICO El análisis estadístico de los datos se efectuará con ayuda del progama SPSS versión 15. El análisis se iniciará con una descriptiva que incluirá la media, el número de casos y la desviación típica para las variables originales. El análisis descriptivo se acompañará con una gráfica de las medias estimadas para cada variable original dentro de cada uno de los grupos experimentales. A continuación, se efectuará un análisis de la varianza (ANOVA) de un factor para las variables, siendo el factor el diferente tratamiento que ha recibido cada uno de los grupos experimentales. En el caso de que el análisis detectase diferencias entre los grupos, tendría sentido realizar comparaciones múltiples para determinar conjuntos homogéneos de grupos experimentales que compartirían la misma media. Como es sabido, no existe una única técnica para llevar a cabo estas comparaciones, dependiendo el resultado final de la que hayamos empleado. En nuestro caso, si fuese preciso utilizaríamos los métodos de Tukey y Scheffé que producen situaciones extremas, particularmente este último que, siendo el más conservador, conduce siempre a un menor número de conjuntos homogéneos (Sokal y Rholf, 1995). RESULTADOS A nivel del asta posterior de la médula, la pregablina reduce el marcaje inducido por ambos estímulos dolorosos. La pregabalina induce la expresión de c-fos en ambos niveles rostrocaudales del núcleo del tracto solitario (NTS), con independencia de la aplicación o no de un estímulo doloroso. Al igual que en el NTS, la pregabalina induce la expresión de c-fos en ambos niveles de la porción lateral del núcleo parabraquial lateral (LPB), con independencia de la aplicación o no de un estímulo doloroso. En el locus coeruleus (LC) tanto la pregabalina, a nivel caudal, como el estímulo doloroso nociceptivo inducen la expresión de c-fos, no así el estímulo doloroso neuropático. Por el contrario, la pregabalina no provocó una intensa inmunorreacción frente a Fos en el núcleo dorsal del rafe (DR), pero sí redujo la expresión de c-fos inducida por el estímulo doloroso nociceptivo. CONCLUSIONES 1.- A nivel del asta posterior de la médula espinal, la pregabalina bloquea la expresión de c-fos inducida por un estímulo doloroso tanto somático superficial como neuropático. 2.- La administración de pregabalina provoca una importante activación de neuronas en el núcleo del tracto solitario, principalmente en los subnúcleos medial (m), central (ce) y ventral-lateral (vl). Por el contrario, dichas neuronas apenas se activan tras un estímulo doloroso, con independencia de que éste sea nociceptivo somático o neuropático. 3.- La administración de pregabalina provoca una importante activación de neuronas en la porción lateral del núcleo parabraquial, principalmente en los subnúcleos externo (elPB) y central (clPB). Asimismo, la aplicación de un estímulo tanto nociceptivo somático superficial como neuropático, también inducen, aunque en menor medida que la pregabalina, la activación de neuronas en el LPB, principalmente en el subnúcleo dorsal (dlPB) y en el área que queda por fuera del subnúcleo central (clPB). 4.- La administración de pregabalina provoca una importante activación de neuronas especialmente en la porción caudal del locus coeruleus. El efecto sobre el LC de un estímulo algésico varía dependiendo de la naturaleza del estímulo: el nociceptivo somático superficial activa de forma importante sus neuronas, mientras que el neuropático no. 5.- La administración de pregabalina provoca una importante activación de neuronas en el núcleo dorsal del rafe, al igual que la aplicación de un estímulo doloroso nociceptivo somático superficial. Por el contrario la aplicación de un estímulo doloroso neuropático no logra la activación de neuronas en el LC. es_ES
dc.format.extent 335 p. es_ES
dc.language.iso es es_ES
dc.subject pregabalina es_ES
dc.subject rata es_ES
dc.subject dolor neuropatico es_ES
dc.title Efecto de la pregabalina sobre la expresión de Fos en el tronco del encéfalo y la médula espinal en dos modelos de dolor neuropático es_ES
dc.type info:eu-repo/semantics/doctoralThesis es_ES
dc.subject.unesco UNESCO::CIENCIAS DE LA VIDA es_ES
dc.subject.unesco UNESCO::CIENCIAS MÉDICAS es_ES
dc.description.abstractenglish In recent decades, there have been significant advances in the search and discovery of new therapeutic strategies against pain. This has been possible thanks to, in large part, a greater knowledge of the underlying mechanisms of pain. Particularly significant have been the data from the anatomical substrate of pain transmission and its endogenous modulation. Based on these anatomical data, pain has been classified in different types: neuropathic pain, when the source of pain is located in the nervous system itself, and non-neuropathic pain, when the origin of pain is located in non-neural anatomical structures, as the skin (superficial nociceptive pain), musculoskeletal system structures (deep nociceptive pain), or internal organs (visceral pain). However, the above mentioned advances are not equally distributed among the types of pain that we have mentioned. Neuropathic pain response to analgesic treatment, or in many other cases even with opioids, is still far from being satisfactory The lack of response of neuropathic pain to analgesic treatment, or in many cases even to opioids, has led therapists to look for other pharmacological solutions. Of all the proposals, the one that is currently be claimed with more strength, is the use of antiepileptic drugs, actually proving to be a valid alternative to treat neuropathic pain (McQuay et al., 1995). The mechanism of action of these anticonvulsant drugs is different from traditional analgesics; while the latter reduce the afferent signals from both healthy and injured tissue, antiepileptic drugs could be called antinociceptive rather than antihyperalgesic, as long as they do not have a per se effect but to reduce the excitability of dorsal horn neurons induced by the damaged of the tissue. One of the antiepileptic drugs first tested in the treatment of neuropathic pain was gabapentin (Dirks et al., 2002, Turan et al., 2004). However, at present, this drug is being replaced by new by-products to increase its efficiency and reduce its adverse effects, among which pregabalin highlights. Pregabalin is the pharmacologically active S-enantiomer of 3-aminomethyl-5-methyl-hexanoic, which is similar to its predecessor gabapentin. Its mechanism of action is not known yet exactly. There are several cellular mechanisms that have been proposed to explain its effect in the treatment of neuropathic pain: acting on NMDA receptors, calcium channels, sodium channels, monoaminergic pathways, opioid and nonopioid systems, … Despite its name and the one of its predecessor molecule, gabapentin has no direct gabaergic action, neither blocks GABA uptake nor its metabolism. Pregabalin, like gabapentin, binds to the alpha2-delta protein subunit of channel voltage-dependent calcium , which might explain its antihyperalgesic effect (Schwarz et al., 2005). Pregabalin has demonstrated antiallodynic and antihyperalgesic activity in several models of neuropathic pain in rodents (Lauria-Horner and Pohl, 2003, Field et al., 1999, Chen and Pan, 2001), these effects being observed at doses of 2 to 4 times lower to those of gabapentin. It also presents a higher tolerability than with other anticonvulsants, including gabapentin, which makes it a valid therapeutic option for the treatment of these patients. The most frequently shown adverse events are: dizziness, drowsiness, peripheral edema, headache, blurred vision and constipation, being all of them usually mild to moderate. Although pregabalin has been used in different types of neuropathic pain, such as post-herpetic neuralgia (Dworkin et al., 2003; Sabatowski et al., 2004), at present its interest is focussed on its effectiveness in post-surgical pain (Dahl et al., 2004). In fact, post-surgical pain can be considered as a type of neuropathic pain that could be considered temporary or reversible. Preclinical studies have shown that surgical incision in the paw of the rat is followed by a prolonged thermal and mechanical hyperalgesia, as a clinical result of central sensitization (Whiteside et al., 2004). These data show that sensitization of dorsal horn of the spinal cord, though reversible in most surgical patients, may be an important algesic mechanism in the first post-interventional days or weeks. Antihyperalgesic drugs, such as pregabalin, thus become post-surgical analgesic, attractive because they offer the possibility to block pathological pain, at the same time that they would allow physiological pain, which would be useful for its protective and alertness function. In the same way, the action of pregabalin would be useful in post-surgical pain if we consider that the mechanism of action of these anticonvulsant drugs differs entirely from that of opiates, thus preventing the decrease in intestinal motility, one of the major adverse effects of opioids in post-surgical patients (Field et al., 1997). These experimental data have been corroborated in the only randomized, double-blind, placebo-controlled trial in postoperative dental pain, and where the results showed statistically significant differences between the group treated with 300 mg of pregabalin and placebo-treated group (Hill et al., 2001). Even though all the experimental studies in animals with pregabalin (Field et al., 1999; Eutamene et al., 2000, Hurley et al., 2002) and human clinical trials that support the clinical use of buprenorphine in neuropathic pain, we were not able to find any work that deepened in the anatomical substrate in which the analgesic effect of this antiepileptic substance underlies at a central nervous system level. The only work that we found studying the effect that the administration of these anticonvlulsant substances, particularly gabapentin, has on the expression of protooncogene c-fos at the level of central Nervis system, is focused on the spinal cord, forgetting the supraspinal level study (Kaneko et al., 2000). Our literature review about the topic has not even showed a single work that pretend to identify the supraspinal neural structures that are activated or at least are altered after the administration of pregabalin in healthy animals, or with different types of neuropathic pain. However, it seems that the identification of brainstem centers altering its neuronal activity by the administration of these substances, would be useful for a better understanding of their mechanisms of action, which would improve their effectiveness both individual use and in combination with other analgesics. OBJECTIVE Identify the brainstem centers involved in the pain modulation circuit, in which the administration of pregabalin provokes significant changes in neuronal activity. The interest of achieving the proposed objectives resides in the idea that clinical studies show that pregabalin has an analgesic effect in those cases in which it neuropathic pain is shown. However, we do not know the nerve centers through which such antihyperalgesic action is shown. Traditional analgesics show their effects modulating the neuronal activity of the different brainstem centers, integrated in the endogenous pain control circuit. To use in a more safe and effective way these new drugs, it is important to identify the neural centers whose activity, measured as changes in the expression of c-fos proto-oncogene in the nucleus of its cells (Harris, 1998), changes after administration of these substances. The study about different algesic stimulation conditions, would also allow us to know how much the substance of our trial, pregabalin, may block at the posterior horn of the spinal Fos expression, due to the arrival at that level of the primary painful afferents. MATERIAL AND METHODS The methodology we will use to develop and achieve the objectives of this project is based on the detection with immunocytochemical techniques of Fos expressing neurons in the brainstem centers involved in pain control circuit, in different experimental situations, as well as the posterior horn of the lumbar segment of the spinal cord. In a more detailed way, the experimental procedure would be the following: A) EXPERIMENTAL ANIMAL This work will be performed in 50 albino rats of Sprague-Dawley, male, weighing approximately 250 g. The animals will be kept under standard laboratory conditions for at least a week before the start of the test: cycles of 12 hours light – 12 hours darkness (the light switches on at 8:00 am and switches off at 8:00 pm ), temperature (15 º C) and constant humidity, standard diet and free access to food and water. B) EXPERIMENTAL GROUPS Animals will be distributed in the following experimental groups: B.1) Physiological control group (CFS) (n = 10): Animals in this group will be used to the handling maneuvers that might be necessary later on during the experiment. These manipulations would be the following: - Take the animal out of the cage and weight it. - Inmobilizate the animal, for 5 seconds, holding it with one hand under its front legs, while they are crossed in saltire in front of its face, and holding its tail with the other hand. This inmobilization maneuver will be performed twice to each animal: the first, once it has been weighed, and the second, half hour later. During the first inmobilization, 1 ml of saline will be injected intraperitoneally (ip). Between one inmobilization and the other, animals will remain in their cages. The animals will be sacrificed 2 hours after the saline ip injection, ie within 2 hours of the second inmobilization. The purpose of this group is to reject that neither the stress of detention, nor the possible pain from ip injection, or even the abdominal distension caused by the introduction of a 1 ml ip volume, shows a pattern of Fos expression that could mask the Fos expression induced by the applied stimulus, analgesic or painful. B.2) Control group Simulated Neuropathically simulated control group(CSN) (n = 10): Similar to the CSF group, except in that a week before, all surgical maneuvers necessary to get the exposure of the sciatic nerve will be made to the animals of this group, so that it may be comparable to the group on which the test of sustained constriction of the sciatic nerve will be applied (Taber et al., 1969), but always avoiding injuries. The purpose of this group is to dismiss that neither the surgical maneuvers necessary to apply the model of neuropathic pain proposed by Taber et al. (1969) will mask the Fos expression induced by the constriction of the nerve. B.3) Pregabalin control group (CPG) (n=10): Rats in this group are injected, on the day of the experiment, 1 ml ip, equal to a dose of 30 mg / kg morphine (Eutamene et al., 2000) during the first immobilization, 2 hours and a half before the slaughter. B.4) Neuropathic Pain Control Group (CRC) (n = 10): Similar to the CSN group, but with the difference that the animals in this group received a painful neuropathic stimulus by the constriction of the sciatic nerve. As mentioned before, the neuropathic pain model chosen in this project is the one proposed by Taber et al. (1969), consisting on the provocation of a sustained constriction of the sciatic nerve. It is performed by 4 ligatures spaced 1 mm on the sciatic nerve trunk at the height of the biceps femoris, with a 4-0 silk. The animals are slaughtered a week after surgery. B.5) Pregabalin + Neuropathic Pain Group (PGDN) (n = 10): The animals in these groups receive a neuropathic painful stimulus, and the day after are injected 1 ml ip analgesic, daily for one week, and after then they are slaughtered. The handling of the animals will be done following the recommendations given by the Ethics Committee of the University of Medicine, in Valencia, as well as those proposed by Zimmermann (1983) for researchs on experimental pain in conscious animals. C) ANESTHESIA AND PERFUSION The animals were sacrificed with an pentobarbital ip overdose (120 mg / kg), starting with the maneuvers of the process of perfusion, once it was checked that the animal was deeply anesthetized (absence of corneal reflex), and the heart was still beating. The whole process of anesthesia and perfusion in any case exceed 15 minutes, to avoid iatrogenic c-fos induction as a result of the handling or the anesthesia itself (Herdegen et al., 1991, Takayama et al., 1994). The infusion started in all cases with a wasing of the vascular tree with 100-200 ml of isotonic heparinized saline (15,000 IU / liter) for then, injecting the fixing solution consisting of phosphate buffer and 4% paraformaldehyde. Once the perfusion process finished, the animals were decapitated, and we started to descaloting and removing the brain and the lumbar spinal cord. D) OBTAINING OF THE SECTIONS Pieces were stored at 4 ° C in the same fixative solution overnight. After this time, they were transferred to a cryoprotective solution with 30% sucrose, in which they remained 24 hours. Once cryoprotected, the pieces were frozen and sectioned with a cryostat in coronal sections of 40 microns thick. E) IMMUNOCYTOCHEMISTRY REVELATION OF THE C-FOS PROTO-ONCOGENE After three washes with PBS to remove sucrose, we proceed to detect the immunocytochemical of the protein encoded by the proto-oncogene object of our study, c-fos, by the ABC method (Hsu et al., 1981). The sections go through successive solutions (Valverde-Navarro et al., 1996). Mounting of the sections: The sections are mounted on gelatinized slides with a solution of 0.5% gelatin and chrome alum 0.05%. Then they are let to dry overnight at room temperature, and the next day, they are dehydrated in increasing ethanol dilutions (70 º, 96 º and 100 º, Panreac), cleared with xylene and covered with Merckoglas. F) SELECTION OF THE LEVELS OF STUDY The levels corresponding to both the spinal lumbar and the brain stem are selected using the Paxinos and Watson atlas (2005). At least 2 sections are selected by each of the chosen levels (Murphy et al., 1995). G) OBTAINING OF DISTRIBUTION PATTERNS OF FOS-POSITIVE NEURONS The distribution pattern of inmurreactivas cells against Fos is obtained from drawings in which the Fos-positive neurons are plucked manually, using a Zeiss camera attached to a Axioskopp Zeiss microscope with a 20x objective. These drawings are made by an experimenter unaware of the experimental group where the preparations belong when they are pointed. H) OBTAINING OF DIGITAL IMAGES OF THE PREPARATIONS Images for the picture study are captured by a NIKON video camera (DXM 1200) attached to a Nikon Eclipse E600 microscope with direct light. I) STATISTICAL STUDY Statistical analysis of data will be carried out using SPSS program, version 15. The analysis will begin with a description including the media, the number of cases and the standard deviation for the original variables. The descriptive analysis will be attached to a graph with the estimated means for each original variable within each of the experimental groups. Then, there will be an analysis of variance (ANOVA) of a factor for the variable, the factor being the different treatment received by each of the experimental groups. In case that the analysis would detect differences between the groups, multiple comparisons would be useful to determine homogeneous sets of experimental groups that would share the same mean. As previously known, no single technique for performing these comparisons exists, depending on the outcome that we have used. In our case, if necessary, we would use the Tukey and Scheffe methods that produce extreme situations, particularly the last one, the most conservative, and that always leads to a smaller number of homogeneous groups (Sokal and Rholf, 1995). RESULTS At the level of the spinal dorsal horn, the pregabalin produces a marking reduction of fos-expression induced by both painful stimuli. Pregabalin induces expression of c -fos at both rostrocaudal levels of the nucleus of the solitary tract (NTS) , regardless of the application or not of a painful stimulus . As in the NTS, pregabalin also induces expression of c-fos in both levels of the lateral portion of the parabrachial nucleus (LPB) , regardless of the application or not of a painful stimulus . In the locus coeruleus (LC) pregabalin, nociceptive pain stimuli induce the expression of c -fos , but not neuropathic pain stimuli. By contrast, pregabalin did not triggered intense Fos immunoreaction in the dorsal raphe nucleus ( DR ), whereas reduced the expression of c-fos induced by the nociceptive pain stimulus. CONCLUSIONS 1. – At the level of the dorsal horn of the spinal cord , pregabalin blocks the expression of c-fos induced by both somatic and neuropathic painful stimuli. 2. - Administration of pregabalin causes significant activation of neurons in the nucleus of the solitary tract, especially in the medial (m), center (c) and ventro-lateral (vl) subnuclei. By contrast, these neurons are activated only after a painful stimulus, regardless of whether it is somatic nociceptive or neuropathic . 3 . - Administration of pregabalin causes significant activation of neurons in the lateral parabrachial nucleus , especially in the external (elPB) and center (clPB) subnuclei. Also, the application of a painful stimulus (both somatic nociceptive and neuropathic) also induce an activation of neurons in the LPB , mainly in the dorsal subnucleus (dlPB) and in the area that remains outside the central subnucleus (clPB), although in a lesser extent than pregabalin. 4 - The administration of pregabalin causes a significant activation of neurons especially in the caudal portion of the locus coeruleus (LC) . The effect of an algesic stimuli on LC varies depending on the nature of the stimulus: somatic nociceptive one significantly actives LC neurons , whereas neuropathic one not. 5 . - Administration of pregabalin causes significant activation of neurons in the dorsal raphe nucleus, such as a somatic nociceptive pain stimulus. By contrast, the application of a neuropathic pain stimulus fails to activate neurons in the LC. es_ES
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