Encontrar buenos modelos de envejecimiento es un objetivo importante de la Gerontología. La diferencia de género en la longevidad, es decir, el hecho de que las hembras viven alrededor del 10% más que los machos en muchas especies, incluida la especie humana, ofrece una oportunidad única para estudiar los aspectos fundamentales del envejecimiento. En el contexto de la teoría mitocondrial de radicales libres en el envejecimiento, estudios realizados por nuestro grupo de investigación han encontrado que la producción de especies reactivas de oxígeno es aproximadamente el doble en los machos en comparación con las hembras (Borras et al., 2003). Así, dichas diferencias de longevidad entre machos y hembras, en parte, podrían ser debidas a los estrógenos, puesto que inducen la expresión de enzimas antioxidantes, como la glutatión peroxidasa selenio-dependiente y la manganeso superóxido dismutasa, al activar vías de señalización intracelular, y ello protege a las hembras frente al estrés oxidativo, y por tanto les confiere una mayor longevidad (Borras et al., 2005). Este hecho hizo plantearnos la posibilidad de intervenir mediante la administración de moléculas miméticas de los estrógenos para reproducir sus efectos favorables sobre la longevidad pero que no presenten el poder feminizante y los inconvenientes atribuidos a los estrógenos. Así pues, elegimos la soja por su composición rica en fitoestrógenos. El papel beneficioso de estas sustancias sobre parámetros de estrés oxidativo y enzimas antioxidantes se ha demostrado previamente por nuestro grupo, tanto in vitro como in vivo (Mahn et al., 2005; Borras et al., 2006). Así, como objetivo principal de la presente tesis, nos planteamos determinar el efecto del consumo de soja sobre la longevidad en ratones OF1 machos. Asimismo, nos planteamos si la modulación de la expresión de “genes antioxidantes” se asocia a cambios reales en la longevidad. Determinar también, si las modulaciones de los “genes antioxidantes” se asocian a cambios reales en la longevidad. Para ello, realizamos una curva de longevidad en ratones OF1 machos, divididos en dos grupos experimentales, 76 alimentados con dieta rica en soja y 81 sin soja. Los animales se controlaron diariamente, y se registró su consumo diario de alimento y su peso semanal. Puesto que la única variable de nuestro estudio es la ingesta o no de soja en la dieta, determinamos la concentración de isoflavonas en el plasma de ambos grupos experimentales mediante cromatografía líquida de alto rendimiento. Se sacrificaron 5 ratones de cada grupo experimental al 100, 80, 50 y 10% de supervivencia, representando las edades de 5, 12, 17.5 and 23.5 meses, respectivamente. Extrajimos las mitocondrias hepáticas mediante centrifugación diferencial para determinar el daño oxidativo, midiendo la producción mitocondrial de peróxido de hidrógeno mediante fluorimetría, la peroxidación lipídica midiendo los niveles de malondialdehído mediante HPLC y la oxidación proteica detectando los grupos carbonilos mediante westen blotting. Como contrapartida a ese daño oxidativo, medimos la defensa antioxidante en tejido hepático, en este caso los genes asociados a la longevidad, manganeso superóxido dismutasa (Mn-SOD) y glutatión peroxidasa (GPx), medimos sus niveles de mRNA mediante RT-PCR, su expresión proteica mediante western blotting y su actividad enzimática por espectrofotometría. También realizamos una serie de pruebas metabólicas, por un lado, estudiamos el perfil metabólico general mediante resonancia magnética nuclear, en plasma y en suspensión mitocondrial. Y por otro lado, estudiamos el consumo cerebral de glucosa in vivo mediante tomografía por emisión de positrones (PET). Los resultados que obtuvimos fueron los siguientes: Cuando determinamos la concentración de isoflavonas en plasma observamos, que los ratones del grupo alimentados con dieta rica en soja mostraron niveles significativamente más altos de genisteína, daidzeína y equol en comparación con el grupo control (alimentado con dieta sin soja). Lo cual demuestra que en efecto, los ratones alimentados con dieta rica en soja habían sido capaces de absorber y metabolizar dichas isoflavonas, y por ello podemos atribuirles los posibles cambios que se produzcan en el resto de la pruebas. Así mismo, cabe destacar que la concentración total de las isoflavonas fue similar a las concentraciones encontradas en la sociedad oriental consumidora de dieta rica en soja de forma habitual como es el caso de los japoneses. Observamos también que el consumo de soja no tiene ningún papel favorable sobre la reducción del peso corporal ni como supresor del apetito, que el perfil metabólico a nivel sérico no cambia con la edad ni con el consumo de soja. Sin embrago, a nivel de las mitocondrias hepáticas sí cambia tanto con la edad como con el consumo de soja. Además, encontramos una correlación positiva entre el envejecimiento y la producción mitocondrial de peróxidos de hidrógeno, y el consumo de soja palía el efecto de la edad sobre dicha producción por las mitocondrias hepáticas. El envejecimiento aumenta los niveles de peroxidación lipídica. No obstante, el consumo de soja evita dicho aumento e incluso lo disminuye al 10% de supervivencia, en las mitocondrias hepáticas. Con el envejecimiento aumenta la oxidación proteica de las mitocondrias hepáticas. El consumo de soja previene dicha oxidación al 80% de supervivencia, sin embargo, la aumenta al 10% de supervivencia. El envejecimiento no afecta ni los niveles de mRNA ni la actividad enzimática de GPx, pero sí incrementa sus niveles proteicos, y el consumo de soja induce su expresión e incrementa su actividad enzimática. Con el envejecimiento disminuyen los niveles de mRNA, pero aumentan los niveles proteicos y la actividad enzimática de MnSOD. El consumo de soja aumenta su expresión al 10% de supervivencia, y su actividad enzimática al 80% de supervivencia. El consumo cerebral de glucosa aumenta con la edad y el consumo de soja sólo lo aumenta al 100% de supervivencia. Finalmente, puesto que no hemos observado diferencias en la longevidad, podemos concluir que el consumo de una dieta rica en soja no alarga ni la vida media ni la vida máxima de ratones OF1 machos, bajo condiciones óptimas de vida, a pesar del aumento de la expresión y la actividad de enzimas antioxidantes.

Finding good models of ageing is a major aim in Gerontology. The different longevity between genders, i.e. females live around 10% longer than males in many species, including humans, offers a unique opportunity to study fundamental aspects of ageing. In the context of the mitochondrial theory of ageing, studies performed by our research group shows that mitochondrial oxidant production is approximately double in males than to females (Borras et al., 2003). We believe this advantage of females is due to the presence of oestrogens, which act via a pathway that comprises membrane oestrogen receptors, MAP kinases, NFkappaB signaling, and the up-regulation of the expression of the antioxidant enzymes MnSOD and GPx (Borras et al., 2005). It is remarkable that oestrogens activate proliferation genes (related to their feminising function and also to their cancer-promoting effects) by binding to oestrogen receptor alpha whereas longevity-related genes, in particular the antioxidant ones, are mediated by binding to oestrogen receptor beta. Furthermore, oestrogen administration after the menopause has clinical problems and, obviously, cannot be given to males. On the other hand, phytoestrogens, which almost all cases bind to the oestrogen receptor beta, promote longevity-related genes without increasing the rate of cell division or promoting feminisation. These substances offer an interesting alternative to oestrogens. In our laboratory, we observed that at concentrations found in plasma of people fed a traditional diet with soya, there was an increase in the expression of antioxidant enzymes (Borras et al., 2006). Thus, the possibility of using these compounds to increase the longevity of males to reach the longevity of females should be seriously considered. In the current study, we performed a longevity curve of 157 male Swiss mice (OF1), divided into two groups. Depending on the type of diet the animals were consuming, either a soya-free diet (similar to the Western diet for humans) or a soya-rich diet (equivalent to the Eastern type diet), since weaning. Here we studied possible differences in longevity, the occurrence of oxidative damage, and antioxidant defence in mice at ages 5, 12, 17.5 and 23.5 months; their survival rate was 100, 80, 50 and 10%, respectively. These represent a broad range of ages, from very young to very old OF1 mice. To obtain blood and organs, five mice were sacrificed in each group at 100, 80, 50, and 10% survival. To test that soya feeding did indeed affect the concentration of isoflavones in plasma of mice fed a soya-rich diet, we measured the concentration of genistein, daidzein, and equol by UPLC. Furthermore, we extracted liver and isolated mitochondria by differential centrifugation to measure parameters of oxidative damage, such as hepatic mitochondrial peroxide production by fluorimetry, lipid peroxidation (determined as malondialdehyde) and oxidised proteins (measured as carbonylation).As antioxidant defence, we measured the expression of longevity-related genes, such as manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) and glutathione peroxidase (GPx) by real time-qPCR. In addition, we determined their protein expression by Western blotting and enzymatic activity by spectrophotometry. We also performed some metabolic tests: on the one hand, we studied the metabolic profile by nuclear magnetic resonance (1H NMR) in plasma and mitochondrial suspension; on the other, we studied the cerebral glucose consumption in vivo using positron emission tomography (PET). Our results show the following: As expected, the plasmatic concentration of these isoflavones was directly correlated; mice fed on the soya-rich diet displayed significantly higher levels of genistein, daidzein, and equol compared with mice fed with the soya-free diet. This means that OF1 mice are able to metabolise soya isoflavones and these concentrations are similar to those obtained in Eastern populations consuming a traditional soya-rich diet. Soya consumption has no effect on reducing body weight or as an appetite suppressant. The serum metabolic profile does not change with age or with soya consumption. However, the metabolic profile in liver mitochondria does change with age and with soya intake. There is a positive correlation between ageing and mitochondrial production of hydrogen peroxide, however soya intake may mitigate the effect of age on this production by liver mitochondria. Ageing increases the levels of lipid peroxidation in hepatic mitochondria. However, soya intake prevents this increase and even lowers it when survival is 10%. Ageing increases protein oxidation in hepatic mitochondria. Soya consumption protects against this oxidation when survival is 80%, however it has a pro-oxidant effect when survival is 10%. Ageing affects neither mRNA levels nor the enzymatic activity of GPx, but increases its protein levels. Soya intake induces its overexpression and increases its enzymatic activity. Ageing decreases mRNA levels but increases protein levels and enzymatic activity of MnSOD. Soya intake induces overexpression of this gene when survival is 10%; however it increases its enzymatic activity when survival is 80%. Cerebral glucose consumption increases with age and soya intake increases this when survival is 100%. The most relevant result is that soya feeding does not increase lifespan (neither maximum nor average) in a controlled population of male OF1 mice, despite the increase in the expression and activity of antioxidant enzymes.