La N–acetilglutamato sintasa (NAGS) cataliza la formación del N-acetilglutamato (NAG) usando como sustratos glutamato y acetil-CoA. En microorganismos y plantas, esta reacción es el primer paso de la ruta de biosíntesis de la arginina, mientras que, en animales, está implicada en el control del ciclo de la urea, ya que el NAG es un activador esencial de la carbamilfosfato sintetasa I encargada de la formación del carbamilfosfato, intermedio en el ciclo de la urea. En humanos, la deficiencia de NAGS produce hiperamonemia y, desde 2002, año en el que el gen de la NAGS humana fue identificado, varias mutaciones han sido publicadas. Esta tesis trata, principalmente, de la NAGS bacteriana clásica de Pseudomonas aeruginosa (PaNAGS), la cual se organiza en dos dominios: uno N-terminal llamado aminoácido quinasa (AAK) que presenta el plegamiento característico de esta familia (α3β8α4) unido por un corto conector a un dominio acetiltransferasa (GNAT). Al inicio de esta tesis, pocos estudios se habían hecho con esta enzima y no se conocía nada de su estructura, pero sí se tenían datos estructurales de la N-acetilglutamato quinasa (NAGK) enzima que cataliza el segundo paso en la ruta de síntesis de la arginina. Esta enzima, cuyo monómero presentaba el plegamiento AAK, era un hexámero, concretamente, un trímero de dímeros conectados por sus hélices N-terminales, siendo éstas responsables, a su vez, de la inhibición por la arginina. En esta tesis, se delinea, mediante mutagénesis dirigida, el sitio para la arginina en la PaNAGS, mostrando la misma localización que en la NAGK. Además, basándose en la conservación de los residuos clave de unión de arginina en la NAGS bacteriana y humana, se propone que el sitio para la arginina sea el mismo en la forma humana. También por medio de mutagénesis dirigida, se demuestra que el dominio GNAT es el que presenta el sitio de unión de los sustratos y el centro catalítico. Una mutación localizada en el dominio AAK, muestra el carácter modulador de este dominio sobre el dominio GNAT, al que le confiere mayor afinidad por el glutamato. Esta hipótesis se ve reforzada con la obtención de los dominios aislados, mostrando que el dominio AAK es hexamérico y no presenta actividad sintasa ni quinasa y que el dominio GNAT cataliza la reacción por sí solo pero con un Km para el glutamato muy alto y sin ser inhibido por la arginina. Para determinar qué dominio AAK confiere afinidad por el glutamato al dominio GNAT, se obtiene una forma truncada de la hélice N-terminal de la PaNAGS, la cual es responsable de la hexamerización de la enzima, obteniendo entonces dímeros. Esta forma, con baja afinidad por el glutamato e insensible a la inhibición por arginina, demuestra que el dominio AAK que modula la actividad del GNAT no es el de la propia subunidad, sino el de la subunidad vecina. Por homología con el mecanismo de inhibición de la NAGK, se propone un mecanismo de inhibición para la NAGS, en el que, la unión de la arginina, produce una expansión del anillo hexamérico de dominios AAK de la NAGS, lo cual provoca que el conector interdominios ejerza una tracción sobre el dominio catalítico GNAT, cambiando su posición y dificultando la catálisis. El mecanismo propuesto, se somete a prueba mediante mutantes de elongación (mostrando abolición de la inhibición) y acortamiento del conector (con inhibición constitutiva, la cual se caracteriza en la forma silvestre por mostrar un aumento en el Km del glutamato y un descenso acusado de la Vmax). Además, modificando la secuencia del conector interdominios, conseguimos que la arginina pase de ser un inhibidor a un activador de la NAGS, como ocurre en la Naturaleza ya que la arginina inhibe las NAGSs bacterianas mientras que activa las NAGSs de mamíferos. Mediante la introducción de dos mutaciones en el dominio AAK de la NAGS, conseguimos recuperar la actividad quinasa, demostrando que el dominio AAK de la NAGS es una NAGK ancestral.