Caracterització bioquímica i funcional de ROT1, una proteïna essencial de S.cerevisiae
NAGIOS: RODERIC FUNCIONANDO

Caracterització bioquímica i funcional de ROT1, una proteïna essencial de S.cerevisiae

DSpace Repository

Caracterització bioquímica i funcional de ROT1, una proteïna essencial de S.cerevisiae

Show simple item record

dc.contributor.advisor Igual García, Juan Carlos es_ES
dc.contributor.advisor Bañó Aracil, María del Carmen es_ES
dc.contributor.author Juanes Ortiz, Mª Angeles es_ES
dc.contributor.other Universitat de València - BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR es_ES
dc.date.accessioned 2010-07-07T15:33:48Z
dc.date.available 2010-07-07T15:33:48Z
dc.date.issued 2008 es_ES
dc.date.submitted 2008-02-20 es_ES
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10550/15839
dc.description.abstract RESUM El creixement polaritzat és un fenomen que ocorre pràcticament en totes les cèl.lules, des de procariots fins a organismes pluricel.lulars sent fonamental per a nombrosos processos cel.lulars incloent la proliferació, diferenciació i morfogènesi. En S. cerevisiae tots els aspectes del creixement polaritzat deriven del citoesquelet d´actina. Atès que el gen ROT1 és un gen essencial de Saccharomyces cerevisiae amb funció desconeguda que es va identificar en un rastreig genètic on es buscaven mutacions supressores de la letalitat de la soca mutant tor2ts . TOR2 està implicat en el control del creixement cellular i en l´organització del citoesquelet d´actina i com que ROT1 suprimeix a la mutació tor2, podria ser que ROT1 estiguera relacionat amb aquestes funcions. Els resultats obtesos indiquen que la inactivació de ROT1 origina un defecte en la progressió del cicle cel.lular amb l´acumulació de cèl.lules en les últimes etapes de divisió cel.lular i l´aparició de cèl.lules regemmades que no finalitzen correctament la divisió cel.lular per un defecte en la septació. Hem averiguat que Rot1 està implicat en el funcionament del citoesquelt d´actina. Encara que no és necessari per al procés de gemmació, Rot1 és essencial per al manteniment del creixement apical en la gemma i per a la repolarització del citoesquelet d´actina al coll entre la cèl.lula mare i filla al final de la mitosi. La supressió del mutant cdc42 per la sobreexpressió de ROT1 i la letalitat sintètica entre la mutació rot1 i mutacions en la ruta d´integritat cel.lular (ruta PKC) reforcen la connexió entre Rot1 i el citoesquelet d´actina. Les funcions del citoesquelet d´actina afectades en el mutant rot1 i el fet que la inactivació de ROT1 suprimeix el defecte d´hiperpolarització del mutant clb2 però no la hiperpolarització de cèl.lules que sobreexpressen CLN2, indica que Rot1 afecta exclusivament els processos del citosquelet d´actina regulats per Clb2 i no per Cln2. Les dades genètiques i fenotípiques obteses reflecten un antagonisme funcional entre Rot1 i Clb2 en el control del citoesquelt d´actina al llarg del cicle cel.lular. Les cèl.lules rot1 són hipersensibles a la sobreexpressió de Clb2 mentre que la seua letalitat se suprimeix per la deleció clb2. A més a més, les mutacions rot1 i clb2 originen efectes contraris en la funció del citoesquelt d´actina, de fet, aquests efectes es compensen en les cèl.lules doble mutant clb2 rot1. Rot1 controla específicament l´estabilitat de la ciclina Clb2, ja que en les cèl.lules mutants rot1 sactiva la ruta MEN i la fosfatasa Cdc14. De fet, la inactivació de ROT1 en cèl.lules que estan degradant activament Clb2 origina l´estabilització de la ciclina. Interaccions sintètiques de ROT1 amb gens implicats en el proteasoma, APC o SCF, i el fet que Rot1 participe en la degradació de Cln2 i substrats de les rutes de degradació de la regla de l´N-terminal i UFD suggereixen una funció més general de Rot1 en degradació de proteïnes. Hem obtés que Rot1 és una proteïna integral de membrana localitzada en la membrana del reticle endoplasmàtic/embolcall nuclear amb orientació luminal modificada per N-glicosilació en les Asn 103, 107 i 139. Analitzant possibles dominis funcionals en la proteïna hem demostrat que l´extrem C-terminal (aminoàcids 229-256) és necessari per a l´ancoratge de la proteïna a la membrana i a més té un paper essencial per a la seua funció. L´extrem N-terminal (aminoàcids 1-25) és essencial per la funcionalitat de Rot1 però no és necessari per a la translocació. La proteïna s´inserta en el reticle endoplasmàtic a través del translocó Sec61 per un mecanisme posttraducional independent de SRP i dependent del complex Sec62/Sec63. __________________________________________________________________________________________________ es_ES
dc.format.mimetype application/pdf es_ES
dc.language cat-en-es es_ES
dc.rights cat es_ES
dc.rights Copyright information available at source archive es_ES
dc.subject none es_ES
dc.title Caracterització bioquímica i funcional de ROT1, una proteïna essencial de S.cerevisiae es_ES
dc.type info:eu-repo/semantics/doctoralThesis es_ES
dc.description.abstractenglish ROT1 is an essential gene whose inactivation causes defects in cell cycle progression and morphogenesis. Rot1 affects actin cytoskeleton during the cell cycle at two levels. Firstly, it is required for the maintenance of apical growth during bud growth. Secondly, Rot1 is necessary to polarize actin cytoskeleton to the neck region at the end of mitosis; as a consequence of this defect, rot1 cells do not properly form a septum to complete cell division. The inability to polarize actin cytoskeleton at the end of mitosis is not due to a defect in the recruitment of the polarisome scaffold protein Spa2 or the actin cytoskeleton regulators Cdc42 and Cdc24 in the neck region. The previous results point to a connection between Rot1 and the Clb2 cyclin. In fact, an overexpression of CLB2 is toxic when ROT1 is partially inactivated and, reciprocally, a deletion of clb2 suppresses the lethality of the rot1 mutation, which indicates a functional antagonism between Clb2 and Rot1. Several genetic interactions suggest a link between Rot1 and the ubiquitin-proteasome system and in fact, we showed that the Clb2 cyclin is not properly degraded in rot1 mutant cells. Rot1 is primarily located at the endoplasmic reticulum-nuclear membrane facing the lumen. Rot1 migrates more slowly than expected which might suggest post-translational modification. Our results indicate that Rot1 is a protein that is neither GPI-anchored nor O-glycosylated. In contrast, it is N-glycosylated. By a directed mutagenesis of several Asn residues, we identified that the protein is simultaneously glycosylated at N103, N107 and N139. Sequence analysis predicts a transmembrane domain at the C-terminus. This fragment neither affects the targeting of the Rot1 protein to the ER nor its N-glycosylation, although it is important for the anchoring of the protein to the membrane and for its functionality. The existence of a signal sequence at the N-terminus has been suggested. However, deletion of this fragment neither impedes translocation to the ER nor N-glycosylation, but it is required for cell viability. Finally, we found that Rot1 is translocated to the ER by an SRP-independent post-translational mechanism which depends on Sec62. es_ES

View       (11.22Mb)

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search DSpace

Advanced Search

Browse

Statistics