Muñoz Forcada, Iciar
Carrillo Estévez, Manuel (dir.); Gómez Peris, Ana (dir.) Universitat de València - FISIOLOGIA |
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This document is a tesisDate2005 | |
Este documento está disponible también en : http://hdl.handle.net/10550/15128 |
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RESUMEN
Este trabajo abarca distintos aspectos de la metodología de la transferencia
génica en lubina, tanto in vitro como in vivo. Por una parte, se ha centrado en el estudio
y evaluación de la transferencia génica somática como posible sustitución a la
transgénesis estable en distintas aplicaciones. Por otra parte, se ha evaluado el sistema
de regulación por tetraciclina para la regulación exógena de genes en peces. Por último,
se ha probado que una línea celular de lubina puede utilizarse como sistema de
expresión de genes exógenos.
Por primera vez se demuestra que la inyección de DNA plasmídico es eficiente
para transferir genes exógenos a músculo de lubina. Los factores que favorecen la
expresión son, dosis altas de plásmido, el uso de un promotor adecuado, y un estado
metabolicamente activo del músculo. La expresión que se obtiene es transitoria,
alcanzándose el máximo...
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RESUMEN
Este trabajo abarca distintos aspectos de la metodología de la transferencia
génica en lubina, tanto in vitro como in vivo. Por una parte, se ha centrado en el estudio
y evaluación de la transferencia génica somática como posible sustitución a la
transgénesis estable en distintas aplicaciones. Por otra parte, se ha evaluado el sistema
de regulación por tetraciclina para la regulación exógena de genes en peces. Por último,
se ha probado que una línea celular de lubina puede utilizarse como sistema de
expresión de genes exógenos.
Por primera vez se demuestra que la inyección de DNA plasmídico es eficiente
para transferir genes exógenos a músculo de lubina. Los factores que favorecen la
expresión son, dosis altas de plásmido, el uso de un promotor adecuado, y un estado
metabolicamente activo del músculo. La expresión que se obtiene es transitoria,
alcanzándose el máximo cinco días después de la inyección. Una limitación de esta
técnica es la incapacidad de reproducir en los distintos individuos inyectados, la
manera exacta en que la aguja de inyección entra en el paquete muscular, lo que
origina una gran variabilidad en cuanto a la toma de DNA por parte de las células, y
por tanto en el nivel de expresión del transgen. Esto se puede mejorar aumentando el
número de animales inyectados para disminuir así el error debido a la técnica, o usando
una segunda construcción para normalizar la transfección.
La técnica de inyección de DNA en músculo se ha ensayado como método de
vacunación en peces. Sin embargo, ésta es la primera vez, que se prueba esta técnica en
peces para secretar una hormona en sangre. Como gen a inyectar se ha diseñado y
construido un gen híbrido que codifica una hormona gonadotropa de cadena única de
lubina. Tras su inyección en músculo de lubina se pudo detectar la proteína en plasma.
Para sistemas de origen piscícola, no se dispone hasta el momento de un método
que permita controlar la expresión de genes exógenos de manera fiable. Por primera
vez, hemos probado la utilidad del sistema de regulación por tetraciclina para esta
misión. Tras valorar diferentes versiones del sistema en células de pez in vitro y en
músculo in vivo, podemos concluir que la opción más eficiente es el uso del
transactivador tTA bajo el control de un promotor estable.
Al igual que en células de mamíferos, hemos comprobado que las células de pez
también presentan dificultades para mantener el sistema de regulación por tetraciclina
de una manera funcional; como resultado, encontrar clones con un grado de regulación
óptimo y un nivel bajo de expresión basal es difícil. Sin embargo, el uso de una
estrategia basada en el uso del plásmido nuevo pTet-luc+-pur/GFP facilita esta tarea, y
permite obtener un alto porcentaje de clones regulables.
A lo largo de este trabajo se han comparado los promotores CMV, de origen
viral, y el promotor de la actina ß de carpa, para dirigir la expresión de distintos genes
tanto en las líneas celulares EPC y SBL, como en músculo de lubina in vivo. Los
resultados nos permite concluir que el promotor de la actina ß de carpa, es más débil en
cuanto al nivel de expresión génica que logra promover, y menos estable a la hora de
mantenerse en una línea celular que el promotor CMV.
Por último, los resultados obtenidos con la línea celular SBL permiten señalar a
esta línea como un sistema de lubina apto para la expresión de genes exógenos. Estas
células son capaces de secretar los productos de los genes introducidos, con lo que
podrían ser utilizadas para la producción de proteínas recombinantes.
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This work focuses on different aspects of the gene transfer methodology in sea bass.
On one hand, the use of the somatic gene transfer has been evaluated as an alternative to the
use of stable transgenesis in different applications. Somatic gene transfer has been used as
method of delivery of a recombinant single-chain gonadotropin into the blood stream in sea
bass. On the other hand, we have evaluated the use of the tetracycline regulated system to
control exogenous gene expression in fish. The results showed that the best choice was the use
of the rtTA transactivator under the control of a stable promoter. Finally, a sea bass cell line
has proven to be an efficient system for the expression of exogenous gene....
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This work focuses on different aspects of the gene transfer methodology in sea bass.
On one hand, the use of the somatic gene transfer has been evaluated as an alternative to the
use of stable transgenesis in different applications. Somatic gene transfer has been used as
method of delivery of a recombinant single-chain gonadotropin into the blood stream in sea
bass. On the other hand, we have evaluated the use of the tetracycline regulated system to
control exogenous gene expression in fish. The results showed that the best choice was the use
of the rtTA transactivator under the control of a stable promoter. Finally, a sea bass cell line
has proven to be an efficient system for the expression of exogenous gene.
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