RESUMEN La propagación de una infección viral en plantas está mediada por unas proteínas codificadas por el propio virus denominadas proteínas de movimiento (MP). Estas proteínas unen el genoma viral de forma cooperativa y sin especificidad de secuencia, formando unos complejos RNA-MP, que se asocian, en la mayoría de casos, al retículo endoplasmático (RE) para ser transportados muy posiblemente a través del citoesqueleto hacia los plasmodesmos, canales membranosos que interconectan las células en plantas. Una vez estos complejos alcanzan los plasmodesmos, el RNA viral es translocado a las células adyacentes a través de un mecanismo todavía desconocido. A pesar de la variabilidad entre las distintas familias virales en el número y tamaño de este tipo de proteínas, se ha descrito que muchas de estas MPs interaccionan con las membranas celulares. Sin embargo, la naturaleza de esta interacción y los mecanismos que subyacen a este fenómeno no se han explorado todavía. Así pues, el objetivo central de la presente tesis se ha basado en el estudio y caracterización de la asociación de estas proteínas con la membrana del RE. El virus objeto de estudio ha sido el Virus del Moteado del Clavel, que codifica dos MPs, p7, una proteína soluble capaz de unir el genoma viral y p9, que presenta dos regiones hidrofóbicas susceptibles de interaccionar con las membranas celulares. En primer lugar, mediante experimentos de transcripción/traducción in vitro se ha demostrado que p9 es una proteína integral de membrana que contiene dos fragmentos transmembrana y adopta una orientación N-/Cterminal citoplasmática. En segundo lugar, se ha caracterizado el mecanismo a través del cual p9 alcanza las membranas celulares. Los resultados obtenidos demuestran que la inserción de p9 tiene lugar de forma co-traduccional y es dependiente de SRP, un complejo ribonucleoproteico que, en general, participa en el direccionamiento de proteínas a la membrana del RE. Además, el virus explota la propia maquinaria celular responsable de la integración de las proteínas de membrana celulares. Así, el complejo Sec61 y la proteína TRAM participan en el proceso de inserción de p9. Entre los resultados obtenidos cabe destacar que (i) los segmentos transmembrana de este virus se integran en la membrana a través de un mecanismo secuencial y ordenado desde Sec61a a TRAM; y (ii) la proteína TRAM media la integración de esta proteína viral desempeñando una posible función de reclutamiento de segmentos transmembrana antes de que éstos particionen conjuntamente a la bicapa lipídica, una vez completada la traducción de la proteína. Finalmente, se ha realizado un estudio de los determinantes topológicos de la proteína que determinan su orientación en la membrana. Se ha explorado la contribución de toda una serie de parámetros, que se han establecido como determinantes en el caso de proteínas de membrana de procariotas o eucariotas. Entre estos factores se encuentran la presencia de residuos cargados en la secuencia de la proteína, la hidrofobicidad de los fragmentos transmembrana, la longitud de dominios extramembranosos y/o la presencia de residuos aromáticos en las regiones flanqueantes de los propios segmentos transmembrana. Los resultados demuestran que la proteína viral p9 presenta la información topológica distribuida a lo largo de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Esta estrategia impediría que la posible aparición de una mutación no conservativa en el gen de la proteína, proceso muy habitual durante la replicación de los genomas virales, alterara la orientación de la proteína en la membrana y en definitiva, comprometiese su función biológica. __________________________________________________________________________________________________

The cell-to-cell movement of plant virus is assisted by the viral so-called movement proteins (MP). Functions assigned to these proteins include nucleic acid binding, targeting to the endoplasmic reticulum (ER), and modification of the size exclusion limit of the plasmodesmata, a membranous channel that connect adjacent cells. Although the number and size of these proteins vary from viral families it has been described that many of the viral MPs interact with the membranes but the nature of this interaction is not well defined yet. Therefore, the main goal of this study is the characterization of MPs interaction to the ER membranes. The Carnation Mottle Virus has been used as an experimental model. This virus encodes two MPs, a cytoplasmic soluble protein of 7 kDa, p7, which binds viral genome, and a hydrophobic protein of 9 kDa, p9, with two putative transmembrane segments. Firstly, it has been demonstrated that p9 is, in fact, an integral membrane protein containing two transmembrane segments and facing both N- and Cterminus to the cytosol. Secondly, it has been dissected the cellular pathway followed by p9 to reach the host membranes. This viral protein is targeted to ER membrane by the signal recognition particle, and the translocon components Sec61a and TRAM mediate p9 integration into the membrane. The unexpected results obtained in these studies are the following: (i) viral TM fragments integrate into the lipid bilayer through a sequentially ordered contact to Sec61a and TRAM; and (ii) TRAM mediates viral protein integration by collecting TM domains, which are only partitioned into the lipid bilayer after translation termination. Finally, it has been studied the topological determinants of p9 that govern the proper orientation of this viral membrane protein. It has been analysed contribution of different parameters such are distribution of positive residues along the protein sequence, hydrophobicity of transmembrane segments, length of extramembranous domains, and presence of aromatic residues flanking transmembrane domains. The results demonstrate that topological information of p9 is distributed along the amino acid sequence. This strategy could avoid any alteration of native topology of p9 due to a random mutation in the protein gene, a common process during viral genome replication.