RESUMEN El objetivo de este trabajo ha sido caracterizar, bioquímica y funcionalmente, una GTPasa bacteriana, la proteína MnmE de E. coli, implicada en la modificación postranscricional de algunos tRNAs. MnmE es una proteína multidominio de 50 kDa que consta de un dominio N-terminal de ~220 residuos, un dominio medio de unión a GTP (dominio G) de ~160 residuos y un dominio C-terminal de ~75 aminoácidos que contiene la única cisteína presente en la molécula. MnmE es una GTPasa cuyas propiedades bioquímicas difieren ampliamente de las mostradas por las GTPasas reguladoras pertenecientes a la familia de las pequeñas GTPasas, típicamente representadas por Ras. MnmE tiene muy baja afinidad por nucleótido y una actividad GTPasa intrínseca alta; además, es capaz de multimerizar. El ciclo GTPasa funciona in vitro sin necesidad de factores adicionales tipo GAPs o GEFs. El dominio G de MnmE aislado conserva una afinidad similar por nucleótidos y la misma capacidad de hidrólisis del GTP que la proteína entera y, sin embargo, no presenta ningún subdominio activador GAP insertado, demostrando que MnmE es un nuevo ejemplo de proteína GTPasa que presenta un mecanismo de activación diferente al dedo de arginina. En este trabajo se ha demostrado que la hidrólisis del GTP realizada por la proteína MnmE es esencial para la función modificadora de los tRNAs. En nuestro modelo proponemos que la hidrólisis del GTP provoca los reordenamientos estructurales en la molécula que le permiten ejecutar su función modificadora. Si es así, MnmE sería el primer ejemplo de una enzima modificadora de tRNAs con actividad GTPasa. Además, en este trabajo hemos establecido la relación entre la presencia de la modificación introducida por MnmE en los tRNAs y la viabilidad celular, demostrando la importancia de la modificación química post-transcripcional para el proceso de descodificación celular, pues este proceso se ve gravemente perjudicado cuando mutaciones que inactivan funcionalmente MnmE se combinan con mutaciones en otros genes implicados en este proceso y que por sí solas no producen fenotipo aparente. ____________________________________________________________________________________________________

The Escherichia coli MnmE protein is a high evolutionarily conserved protein with GTPase activity. MnmE has a molecular mass of 50 kDa and is organized as a multidomain protein consisting of an ~220 amino acid N-terminal domain, a middle GTPase domain of about 160 residues, and a ~75 amino acid C-terminal domain, wich contains the only cysteine residue present in the protein. MnmE exhibits a very high intrinsic GTPase activity rate and low affinity for GTP and GDP and it can form self-assemblies, these unusual biochemical properties differs extensively MnmE from regulatory GTPase proteins such Ras. In vitro, the GTPase cycle works without any additional factor such GAPs or GEFs. The isolated GTPase domain roughly conserves the guanine binding and GTPase activities of intact MnmE molecule and strinkingly doesnt present any inserted activation subdomain. MnmE is a new example of a GTPase protein that follows an alternative activation mechanism without an arginine finger. MnmE is involved in the modification of the uridine at the wobble position of certain tRNAs. In this work we examine the biochemical and functional consequences of altering amino acid residues within the GTPase and C-terminal domain of MnmE. Our results indicate that the MnmE tRNA modifying function requieres effective hydrolysis of GTP and not only GTP binding as in most of the GTPases. We propose that MnmE uses the conformational change associated with GTP hydrolysis to promote the tRNAs modification reaction, in witch the C-terminal Cys may function as a catalytic residue. We also demonstrate thet point mutations abolishing the tRNA modifying function of MnmE confer synthetic lethality wich stresses the importance of the tRNA modification function in the mRNA decoding process.