RESUMEN de la MEMORIA de TESIS DOCTORAL titulada: CONTROL OF THE ACTIVITY OF RUBISCO FROM CHLAMYDOMONAS REINHARDTII THROUGH THE REDOX STATE OF ITS CYSTEINE RESIDUES. presentada por HEMANTH PHANI KUMAR SUDHANI para optar al título de DOCTOR dentro del Programa Oficial de Posgrado en BIOTECNOLOGÍA (D030-01) de la Universitat de València. Tema: La actividad del enzima fijador de carbono en eucariotas fotosintéticos, la ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilas/oxigenasa (Rubisco), puede regularse in vitro por efectores redox. Esta capacidad existe en los enzimas de todas las especies eucarióticas ensayadas y se supone que reside en un número relativamente reducido de residuos de cisteína conservados, cuyo estado redox influye en la conformación del sitio catalítico a través efectos estructurales a larga distancia. Este mecanismo de regulación parece hayarse implicado en el control del catabolismo de la Rubisco durante procesos de senescencia natural e inducida por situaciones ambientales adversas que generan condiciones oxidantes. Sin embargo, se desconocen detalles acerca de los posibles efectores redox que pudieran modular la actividad del enzima in vivo, así como de los residuos de cisteína implicados. Para clarificar el papel que juega cada uno de los residuos conservados de cisteína en este mecanismo de regulación se ha iniciado la obtención y el estudio de mutantes del alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii en los que se ha sustuido algún residuo conservado de cisteína de la Rubisco por serina. Previamente se han estudiado ya los mutantes en los residuos 172, 192, 449 y 459, habiéndose encontrado que las mutaciones producen alteraciones fenotípicas como el retraso en la degradación del enzima (caso del mutante Cys 172) o su agregación en condiciones oxidativas (caso de los mutantes en las Cys 449 y 459). Estos resultados abren la posibilidad de una posible manipulación biotecnológica de la degradación de la Rubisco durante la senescencia, un proceso de enorme importancia nutricional para las plantas superiores ya que el catabolismo de esta abundante proteína proporciona hasta un 50 % del nitrógeno y azufre movilizado desde las hojas a los nuevos tallos, flores y frutos en fases de crecimiento. Objetivos: El objetivo de la tesis es continuar la elucidación del mecanismo redox que controla la actividad y estabilidad de la Rubisco, identificando y caracterizando el papel de los diferentes residuos críticos de cisteína implicados en la regulación, determinando la naturaleza de los efectores redox que pueden controlar la actividad del enzima (revisando especialmente el papel del glutatión, que es el tampón redox más importante del cloroplasto) e investigando el mecanismo de inhibición del enzima pot arsenito. Metodología: En los experimentos se ha utilizado la Rubisco del alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii, un organismo modelo para estudios del cloroplasto, y que, en la actualidad, es uno de los pocos que admite la transformación del genoma cloroplástico. El estudio se ha llevado a cabo mediante varios abordajes distintos: 1) Análisis de mutantes con sustitución de cisteínas de Rubisco en C. reinhardtii. Se ha analizado el fenotipo de mutantes ya obtenidos (con sustituciones simples de las cisteínas 84, 247, 284 y 427 de la subunidad grande y 41 y 83 de la subunidad pequeña) y las propiedades del enzima purificado de ellos con objeto de caracterizar la contribución de cada residuo al mecanismo de regulación. Para ello se han purificado las Rubiscos de cada uno de los mutantes y se han sometido a incubación con tampones redox y tratamientos con agentes modificadores de cisteína, para detectar diferencias en los efectos de estos agentes sobre la actividad en comparación con el enzima silvestre. 2) Estudio de la secuencia temporal de oxidación de cisteínas Se ha realizado un marcaje químico diferencial de las cisteínas reducidas y oxidadas de la Rubisco a lo largo de un barrido de condiciones redox (logrado mediante equilibrado del enzima con un mezcla de un oxidante y un reductor en distintas proporciones) y se ha analizado el progreso de la oxidación de cada uno de los residuos mediante fragmentación tríptica y análisis de los fragmentos por espectrometría de masas. El objeto de este experimento es establecer una secuencia temporal de oxidación de cisteínas, tal como puede ocurrir in vivo cuando, en condiciones de senescencia, el entorno del enzima se vuelve progresivamente más oxidante. 3) Estudio de la inactivación de la Rubisco por distintos efectores redox. Se ha probado la inactivación y reactivación del enzima por diferentes disulfuros y tioles y otros reactivos específicos de cisternas. Específicamente se ha estudiado la posibilidad de que el glutatión pueda controlar la actividad de la Rubisco directamente por intercambio de disulfuros o de forma indirecta, a través de efectores redox mediadores. Se ha investigado también el mecanismo de inhibición de la Rubisco por arsenito y el efecto potenciador que producen los tioles en este proceso. Conclusiones: A. Respecto al papel del glutatión en la regulación redox de la actividad de la Rubisco: 1. La Rubisco puede inactivarse por intercambio de disulfuros mediante diversos compuestos disulfuros y, posteriormente, puede ser reactivada por diversos tioles. Sin embargo, ni el glutatión oxidado ni el reducido puede afectar a la actividad de la Rubisco por intercambio directo de disulfuros debido a la existencia de barreras cinéticas. 2. El ascorbato no puede mediar la modulación redox de la Rubisco por el glutatión in vitro. Sin embargo, el glutatión reducido puede impulsar la reactivación de la Rubisco oxidada mediante una pequeña cantidad de pequeños tioles intermediarios (como la cysteamina o la cisteína). El proceso contrario (la inactivación de la Rubisco por el glutatión oxidado utilizando pequeños disulfuros como mediadores) no progresa si los intermediarios se mantienen a una concentración inferior a la del glutatión. 3. El S-nitrosoglutatión puede actuar como donante de óxido nítrico inactivando a la Rubisco por transnitrosación de sus residuos de cisteína. Sin embargo, en el caso del enzima de Chlamydomonas reinhardtii, el S-nitrosoglutatión no es un donador eficiente para esta reacción ya que se necesita una concentración demasiado alta (no esperable in vivo) para producir una inactivación mayoritaria de la Rubisco. B. Respecto a la identidad de las cisteínas críticas de la Rubisco: 4. La sensibilidad a cistamina que muestran las Rubiscos de C. reinhardtii, espinaca y arroz sugiere que la inactivación ocurre por intercambio de disulfuros con cisteínas que se encuentran entre los residuos comunes conservados. Estas son las cisteínas 84, 172, 192, 247, 284, 427 y 459 de la subunidad grande, y las cisteínas 41 y 83 de la subunidad pequeña. 5. Ninguna de las sustituciones simples de las cisteínas conservadas pormutagénesis elimina la inactivación de la Rubisco por intercambio de disulfuros con cistamina. Esto sugiere que la inactivación se produce por oxidación de varias cisteínas que contribuyen de forma redundante a la inhibición de la Rubisco. 6. La sustitución de la cisteína 427 (o de la cisteína 192 que ya se ha descrito anteriormente) produce una Rubisco mutante que es más sensible a la inactivación oxidativa. Esto sugiere que estos dos residuos juegan un papel protector, interfiriendo con la modificación de las cisteínas críticas (o con las cambios conformacionales a los que dan lugar) y, de esta manera, retrasando la inhibición. 7. Una revisión de todos los datos actualmente recogidos indica que las cisteínas 172 y 459 de la subunidad grande y 41 de la subunidad pequeña son los candidatos más probables a impulsar la inactivación y susceptibilización proteolítica de la Rubisco cuando se oxidan por intercambio de disulfuros. C. Respecto al mecanismo por el que los tioles incrementan el efecto inhibitorio del arsenito sobre la Rubisco: 8. El arsenito por sí solo inhibe el 80% de la actividad de la Rubisco a concentraciones que se hallan por encima del rango milimolar. Sin embargo, cuando se combina con ciertos monotioles (como cisteamina, cisteína, N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol, pero no glutatión reducido) alcanza una inhibición completa a concentraciones en el rango submilimolar. En cambio, ditioles como el ditiotreitol no potencian la inhibición del arsenito. 9. El monotiol no actúa reduciendo un disulfuro previo ni juega un papel catalítico sino que se integra con el arsenito y la Rubisco en un complejo ternario que inactiva al enzima. Se sugiere que, en el complejo final, el átomo de arsénico está enlazado a tres átomos de azufre correspondientes al monotiol y a las cisteínas vecinas 172 y 192 de la subunidad grande de la Rubisco. 10. La estabilidad del complejo ternario es muy dependiente del monotiol particular que lo integre, siendo la constante de asociación dos órdenes de magnitud mayor cuando el tiol es mercaptoetanol que cuando es cisteamina. En cualquier caso, la asociación es totalmente reversible desmantelándose el complejo al desalar para eliminar las formas libres de arsenito, monotiol o ambos. 11. La combinación de arsenito y un monotiol puede también suprimir la fijación de carbono por parte de un cultivo fotosintetizante de C. reinhardtii de forma totalmente reversible. Sin embargo, la inhibición in vivo no es causada por la inactivación de la Rubisco sino que afecta a un sensor indeterminado que es todavía más sensible que la Rubisco al sinergismo entre arsenito y monotiol.