Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata) es el insecto defoliador de patata de mayor importancia económica a nivel mundial, que también puede atacar otras plantas de interés económico como berenjena y tomate, y que ha desarrollado resistencia frente a un gran número de los insecticidas químicos utilizados para combatirlo. Las toxinas Cry de Bacillus thuringiensis, las cuales son altamente específicas para sus dianas e inocuas para los vertebrados, la gran mayoría de los invertebrados y las plantas, constituyen una herramienta de gran valor para el control de esta plaga, sin provocar efectos perjudiciales sobre el medio ambiente. En el presente trabajo hemos profundizado en el estudio del modo de acción de la toxina Cry3Aa de B. thuringiensis en L. decemlineata, centrándonos en los eventos que tienen lugar como consecuencia de su interacción con la membrana del epitelio intestinal. Hemos encontrado que la toxina Cry3Aa interactúa con proteínas localizadas tanto en los lipid rafts como fuera de estos microdominios de membrana, entre las que hemos identificado, por homología de secuencia, las proteínas prohibitina-1 y -2, RACK1, anexina, actina, y V-ATPasa, proteínas cuya interacción con Cry3Aa no había sido descrita, ni se habían previamente identificado en L. decemlineata. Como resultado de su interacción con la membrana del epitelio intestinal, la toxina Cry3Aa se proteoliza por proteasas asociadas a dicha membrana. La proteólisis tiene lugar por regiones expuestas del dominio III de Cry3Aa y es catalizada por cisteín proteasas de la familia de las intestaínas y por metaloproteasas probablemente de la familia de las ADAM. El reconocimiento de la toxina Cry3Aa por las metaloproteasas ADAM debe producirse a través de una secuencia localizada en el lazo 1 del dominio II. Mediante el análisis de la influencia de moduladores de la actividad proteolítica de metaloproteasas ADAM en la proteólisis de la toxina Cry3Aa, catalizada por vesículas de la membrana del borde en cepillo del epitelio intestinal, comprobamos que el compuesto extractor de colesterol MCD disminuye la proteólisis de la toxina y el inhibidor de calmodulina TFP produce su incremento. La unión de la proteína calmodulina a Cry3Aa impide la proteólisis de la toxina catalizada por las metaloproteasas ADAM asociadas a la membrana. Desde el punto de vista funcional, el procesado proteolítico de la toxina Cry3Aa catalizado por las metaloproteasas de tipo ADAM es necesario para su toxicidad en células disociadas del epitelio intestinal y en larvas de L. decemlineata.The Colorado potato beetle (CPB), Leptinotarsa decemlineata (Say) is an exceptionally destructive insect pest for potato, tomato, eggplant and other solanaceous crops, responsible of important economic losses in agriculture, which to date has developed resistance to a wide variety of synthetic chemical insecticides. Bacillus thuringiensis (Bt) Cry3Aa toxin based bioinsecticides, which are highly specific, safe for users and the environment, represent a viable alternative for the biological control of this important agricultural pest. In the present work we have deepened in the study of Bt Cry3Aa toxin mode of action in CPB, focusing in the analysis of Cry3Aa toxin interaction with CPB midgut epithelium membrane. We have found that Cry3Aa toxin binds to both lipid rafts and non-rafts membrane associated proteins, among them, we have identified by sequence homology the proteins prohibitins-1 and -2, RACK1, annexin, actin and V-ATPase, which interaction with Cry3Aa toxin or identification in CPB, have not been previously reported. As a result of Cry3Aa interaction with CPB midgut epithelium, the toxin is proteolyzed by membrane associated proteases. Cry3Aa toxin proteolysis takes place in domain III exposed regions and it is catalyzed by digestive cysteine proteases intestains and metalloproteases probably belonging to the ADAM family. CPB ADAM like metalloproteases must recognize Cry3Aa toxin by a region located in loop I of domain II. The analysis of the influence of modulators of ADAM metalloprotease activity in Cry3Aa proteolysis, catalyzed by midgut brush border membrane vesicles, shows that the cholesterol extracting compound MCD decreases Cry3Aa proteolysis and the calmodulin inhibitor TFP enhances proteolysis. Cry3Aa binding to calmodulin prevents toxin proteolysis catalyzed by CPB ADAM like metalloproteases. From a functional standpoint, Cry3Aa toxin proteolysis catalyzed by CPB ADAM like metalloproteases is a key event in Cry3Aa toxicity against CPB larvae and dissociated midgut epithelium cells.