El intestino de los insectos es una de las principales vías de entrada de entomopatógenos. Con el fin de minimizar los efectos negativos de los patógenos, el intestino de los insectos posee diferentes mecanismos: síntesis de péptidos antimicrobianos, producción de especies reactivas de oxígeno, activación de los sistemas de reparación y detoxificación, melanización, fagocitosis, apoptosis y la renovación celular, entre otros. Estudios de expresión tras la exposición a diferentes patógenos han mostrado cómo la expresión de ciertos genes varía en el intestino tras la infección. Previamente a la realización de esta tesis, se identificó, en el lepidóptero Spodoptera exigua, una familia de genes que aumentaba sus niveles de expresión en el intestino tras la exposición a la toxina Cry1Ca de Bacillus thuringiensis y a baculovirus. Esta familia, compuesta por cuatro miembros en su inicio, se denominó repat (por respuesta a patógenos). Al comienzo de esta tesis no se disponía de información sobre el papel de estos genes en la respuesta a patógenos. Es por ello que el objetivo principal de esta tesis ha consistido en profundizar en el conocimiento sobre la familia REPAT, tanto en el estudio de su función a nivel molecular como en determinar sus implicaciones en la respuesta del intestino de los insectos a distintos microorganismos entomopatógenos y sus factores de virulencia. En un primer capítulo, la comparación a nivel transcripcional entre una población de S. exigua susceptible y otra resistente, a un producto comercial basado en B. thuringiensis (XentariTM), mostró una elevada expresión constitutiva de cuatro genes repat en la población resistente. Tres de estos genes repat eran nuevos, se secuenciaron y se nombraron como repat5, repat6 y repat7. Además, se observó una correlación positiva entre la expresión de repat5 y la resistencia al producto XentariTM. En un segundo capítulo tratamos de aproximarnos a la función molecular de estos genes a través del estudio de las proteínas que interaccionan con REPAT1 mediante la técnica del doble híbrido. Para ello se construyó una genoteca que contiene los genes que se expresan en el intestino de larvas de quinto estadio de S. exigua. En los experimentos de doble híbrido en levaduras se observó que dos proteínas interaccionaban con REPAT1. Estas proteínas eran REPAT4 y una nueva proteína similar a ésta, que se secuenció y se nombró como REPAT8. En estudios de localización celular se observó que REPAT1 se encuentra en el citoplasma celular, pero en presencia de REPAT8 aparece también en el núcleo. El análisis de la expresión de los ocho genes descritos hasta el momento mostraron una respuesta general a los tratamientos relacionados con B. thuringiensis (toxina Cry1Ca, XentariTM y una cepa de B. thuringiensis que no produce toxinas Cry, Bt cry-) y no frente a otros tratamientos con bacterias no patógenas (Escherichia coli, Enterococcus spp. y otras presentes en su microbiota), sugiriendo que la expresión de estos genes se activa principalmente en respuesta al daño celular. En un tercer capítulo, aprovechando la reciente secuenciación del transcriptoma de S. exigua por parte de nuestro grupo, tratamos de identificar nuevos genes repat. El análisis del trancriptoma reveló la presencia de al menos 46 miembros diferentes. El análisis de estas secuencias mostró la presencia de ciertos motivos conservados, así como la posible clasificación de sus miembros en dos grandes clases: αREPATs y βREPATs. Además, en este capítulo estudiamos la expresión de esta superfamilia de genes, observando un cambio en la expresión en intestino de los αrepats tras la intoxicación con Cry1Ca pero no en respuesta a un aumento de la microbiota en el intestino de las larvas. Interesantemente, al estudiar la expresión de estos genes en las células madre del intestino (en comparación a la expresión en el intestino completo), las larvas con mayor carga bacteriana mostraron un mayor número de genes repat expresados en estas células madre. El aumento del número de genes repat en S. exigua ha permitido la identificación de homólogos en otras especies de insectos: Spodoptera frugiperda, Spodoptera littoralis, Spodoptera litura, Mamestra configurata, Mamestra brassicae, Helicoverpa armigera, Bombyx mori y en el díptero Drosophila melanogaster. En el organismo modelo D. melanogaster se identificaron dos homólogos: CG13323 y CG13324. Dado que en Drosophila existen herramientas moleculares no disponibles para S. exigua, se decidió estudiar la función de estos homólogos para profundizar en el conocimiento de estos genes. Para ello se obtuvo, tanto un mutante con la deleción de CG13323 y CG13324, como mutantes de sobreexpresión de CG13323. El mutante con ambos genes delecionados mostró un aumento en la supervivencia a la infección con Pseudomonas entomophila, lo cual resultó contrario al resultado esperado, ya que los genes han mostrado aumento de su expresión después de la infección. También se observó un aumento en la supervivencia, tanto de larvas como de adultos, en los mutantes que sobreexpresan CG13323. Para comprobar si CG13323 estaba implicado en alguna de las rutas del sistema inmune de D. melanogaster, se estudió la expresión de algunos genes marcadores (diptericina de la ruta Imd, upd3 de la ruta JAK-STAT y vein de la ruta EGF), no encontrándose ningún cambio relacionado con la sobreexpresión de CG13323 que nos permitiera situar los genes repat en algunas de las principales rutas del sistema inmune de insectos. Debido a las características de los genes repat y las proteínas que codifican: la gran cantidad miembros de la misma familia, su diferente respuesta a nivel de expresión, el pequeño tamaño de las proteínas, la interacción entre miembros de la misma familia que produce su translocación nuclear, y la homología de alguno de sus miembros a factores transcripcionales como es MBF2, sugieren la posibilidad de que diferentes combinaciones de proteínas REPAT podrían ser responsables de la regulación de la transcripción de genes implicados en distintos aspectos de la fisiología del insecto.

The insect gut is one of the main routes of entrance of entomopathogens. In order to minimize the negative effects from pathogens, insect gut possesses several mechanisms: synthesis of antimicrobial peptides, production of reactive oxygen species, activation of repair and detoxification systems, melanization, phagocytosis, apoptosis and cell renewal, among others. Expression analysis has shown differences in the transcription profile of certain genes in the insect gut due to the exposure to different pathogens. Prior to the start of this thesis, a family of genes was identified in the lepidopteran Spodoptera exigua by their increased expression in midgut after exposure to Cry1Ca toxin from Bacillus thuringiensis and to baculovirus infection. This family, initially composed by four members, was named REPAT (in REsponse to PAThogens). At the beginning of this thesis, no information about the molecular function of this new family of genes was available. With the current thesis we plan to increase our knowledge about the REPAT family and its implications in the insect gut response to entomopathogenic microorganisms and their virulence factors. In the first chapter, comparing the gene expression profiles of B. thuringiensis-resistant and susceptible colonies of S. exigua, four repat genes showed a higher constitutive expression in the resistant population. Three of these repat genes were novel and they were sequenced and named as repat5, repat6 and repat7. Moreover, a positive correlation was observed between the expression of repat5 and the resistance to the XentariTM product. In a second chapter we advanced to the molecular function of these genes through the study of proteins that interact with REPAT1 using the yeast two-hybrid technique. With that purpose, we constructed a cDNA library containing genes that are expressed in the midgut of fifth instar larvae of S. exigua. In the yeast-two hybrid experiments, two proteins showed interaction with the REPAT1 protein. These proteins were REPAT4 and a novel protein similar to this one, which was sequenced and named REPAT8. In cellular localization studies, REPAT1 was found in the cellular cytoplasm, but in the presence of REPAT8, REPAT1 also appears in the nucleus. The expression analysis of the eight repat genes described so far showed an overall response to the treatments related to B. thuringiensis (Cry1Ca toxin, XentariTM and a B. thuringiensis strain that does not produce Cry toxins, Bt cry-) but not with the treatments of non-pathogenic bacteria (Escherichia coli, Enterococcus spp. and other present in their microbiota), suggesting that the expression of these genes is activated mainly in response to cell damage. In a third chapter, taking advantage of the recent sequencing of the S. exigua transcriptome by our group, we tried to identify novel repat genes. The transcriptome analysis revealed the presence of at least 46 different members. Analysis of these sequences showed the presence of certain conserved motifs and their possible classification into two main classes: αREPATs and βREPATs. Also in this chapter we studied the expression of this gene superfamily, observing a change in the expression of αrepats in the midgut after exposure to Cry1Ca but not by an increased of microbiota in the larval gut. We studied the repat gene expression in midgut stem cells compared with the whole midgut tissue from S. exigua larvae. Interestingly, larvae with higher bacterial load in midgut showed a higher number of genes expressed in these stem cells. The increase of the number of sequences in S. exigua has allowed the identification of homologs in other insect species: Spodoptera frugiperda, Spodoptera littoralis, Spodoptera litura, Mamestra configurata, Mamestra brassicae, Helicoverpa armigera, Bombyx mori and the dipteran Drosophila melanogaster. In the model organism D. melanogaster, two homologs were identified: CG13323 and CG13324. Since in Drosophila there are molecular tools that are not available in S. exigua, we decided to study these homologous genes to increase our knowledge about repat genes. With that purpose, two types of mutants were obtained: a mutant with the deletion of CG13323 and CG13324, as well as CG13323 over-expressing mutants. The mutant with both deleted genes showed an increase in survival to Pseudomonas entomophila infection, which was contrary to the expected result because the genes showed increased expression after infection. There was also an increase in the survival of both larvae and adults in CG13323 over-expressing mutants. To test whether overexpression of CG13323 was involved in some of the routes of the immune system of D. melanogaster, we studied the expression of some marker genes (diptericin for the Imd pathway, upd3 for the JAK-STAT pathway and vein for the EGF pathway), finding no changes related to the over-expression of CG13323 and enabled us to locate the repat genes in some of the main routes of the insect immune system. Due to the characteristics of these genes and their encoded proteins: the large number of members of the same family, their different response at the expression level, the small size of the proteins, the interaction between members of the same family that produces nuclear translocation, and the homology of some members with transcriptional factors such as MBF2, suggest the possibility that different combinations of REPAT proteins could be responsible of transcriptional regulation of genes involved in various aspects of the insect physiology.