RESUMEN Las señales mediadas por los Receptores Nucleares de Hormonas desempeñan un importante papel en el control de la diferenciación celular. El objetivo de este trabajo es analizar los mecanismos moleculares a través de los cuales se ejerce este control. Como sistema experimental utilizamos células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, cuya diferenciación se induce mediante tratamiento con ácido retinoico (RA) que produce la parada en el crecimiento y desencadena la diferenciación celular. Estudiar el mecanismo molecular a través del cual, actúa el RA, también resulta interesante desde un punto de vista biomédico, puesto que los retinoides y sus derivados sintéticos son utilizados en la terapia de neuroblastoma y también de otros tipos de cáncer. Mediante Display Diferencial Ordenado hemos identificando 43 genes regulados (positiva o negativamente) por RA en células SH-SY5Y, entre los que se incluyen factores de transcripción y proteínas relacionadas con el ciclo celular, la transducción de señales y las funciones neuronales. Entre los genes regulados negativamente por RA se encuentra ID3, un factor de transcripción de la familia de los HLH, los cuales desempeñan un papel crucial en la diferenciación celular. ID3 actúa inhibiendo la unión al DNA de ciertos factores de la familia HLH. ID3 bloquea la diferenciación interfiriendo con la actividad de factores HLH neurogénicos. Cuando la expresión de ID3 se reduce por efecto de RA, se activa la cascada de bHLH proneurales, desencadenando la diferenciación celular. La expresión de otros genes bHLH cambió durante la diferenciación inducida por RA: la expresión del gen específico de neuroblastos en proliferación ASCL1 (HASH-1) disminuyó rápidamente tras 6 h de tratamiento con RA, mientras que la expresión de genes promotores de la diferenciación aumentó como es el caso de NEUROD6 y NEUROD1. Los niveles de otros miembros de la familia de los IDs (ID1, ID2) están regulados también negativamente durante la diferenciación inducida por RA en células SH-SY5Y. Mediante Western Blot estudiamos los niveles de proteínas ID1, ID2 e ID3 en células SH-SY5Y tratadas a diferentes tiempos con RA. Los niveles de proteínas disminuyen de manera notoria tras 24 h de tratamiento con RA, en paralelo a lo observado a nivel de ARN mensajero. Los resultados obtenidos indican que el RA produce una regulación negativa coordinada de los genes IDs. El tratamiento con otros inductores de la diferenciación como es el caso del TPA, también dio lugar a una regulación negativa y coordinada de los genes IDs. Esto resalta la importancia de estos genes en los procesos de diferenciación celular. Además hemos visto que la regulación negativa y coordinada de los genes IDs por tratamiento con RA es un mecanismo complejo que implica síntesis de nuevas proteínas y actividad fosfatidil-inositol-3-kinasa (PI3K). El tratamiento con RA activa la vía de señalización intracelular de la PI3K/AKT, resultando en un incremento en la actividad PI3K de extractos de células tratadas con RA y un rápido incremento en la fosforilación de la proteína diana AKT en Serina 473. La activación de la vía PI3K/AKT es necesaria para la diferenciación celular, y probablemente tiene una gran relevancia a nivel fisiológico, puesto que acopla procesos vitales como son la diferenciación y la supervivencia celular. Aunque el mecanismo molecular por el cual el RA activa la vía PI3K/AKT no está todavía definido, los resultados obtenidos indican que, probablemente, podría tratarse de una acción extragenómica del RAR, entre otras razones por la rapidez con la que se produce. Hemos tratado de caracterizar el mecanismo por el cual el RA activa la vía PI3K/AKT. En principio partimos de la hipótesis de que el RA pudiera inducir la expresión de una tirosina-kinasa que fuera capaz de activar la PI3K. Hemos encontrado un buen candidato para esta actividad: RET, el receptor de la familia de neurotrofinas del GDNF, es inducido directa- y fuertemente por RA. En las células SH-SY5Y se expresa uno de los co-receptores que actúa junto a RET, el GFRA2, pero no hemos logrado detectar la expresión de ninguno de los ligandos de la familia del GDNF, que pudiera activar RET actuando de un modo autocrino/paracrino. Por otro lado, no hemos podido observar fosforilación de RET en residuos tirosina, lo que probaría su activación. Estos resultados apoyan la hipótesis que planteamos en la cual el RA desempeñaría una acción de tipo no genómica. Los resultados obtenidos, nos llevan a postular, que el RA desempeña un papel muy importante en la regulación de la supervivencia de las células neurales. La regulación positiva del gen anti-apoptótico BCL2 durante la diferenciación inducida por RA en células de neuroblastoma es un hecho conocido desde hace tiempo, y la diferenciación incrementa la resistencia a la apoptosis inducida por drogas. También se han descrito efectos del RA sobre la supervivencia celular en cultivos primarios de neuroblastos de médula espinal y en neuronas derivadas de células madre neurales. Los resultados presentados aquí proporcionan un mecanismo molecular para explicar estos efectos. Además, pensamos que el fenómeno aquí descrito en células de neuroblastoma pudiera ser relevante en la diferenciación neural en general. La coordinación de las acciones genómicas y extragenómicas del RA da lugar al acoplamiento entre la diferenciación y la supervivencia celular. Por una parte el RA regula la transcripción de genes específicos implicados en diferenciación celular. Por otra parte, a través de una acción extragenómica, el RA activa la vía de PI3K/AKT, que está implicada en la supervivencia celular. Los dos tipos de acciones no se producen de un modo independiente, sino que están entrelazados. La activación extragenómica de la vía PI3K/AKT también está implicada en la regulación transcripcional de genes decisivos para la diferenciación, como hemos demostrado en el caso de la regulación negativa coordinada de los genes IDs. Recíprocamente, el RA puede contribuir a la supervivencia celular a través de la regulación transcripcional positiva de receptores de neurotrofinas, como RET y de trkB. Este acoplamiento entre diferenciación y supervivencia es un fenómeno novedoso. __________________________________________________________________________________________________ SUMMARY Nuclear Hormone Receptors (NHR) are key regulators of cell differentiation. We have used the neuroblastoma cell line SH-SY5Y, that undergoes terminal differentiation after addition of Retinoic Acid (RA), as a model system to study the molecular mechanisms through which NHR control this process. By using Ordered Differential Display-PCR we have identified more than 50 genes differentially expressed in RA-treated SH-SY5Y cells. We have found that the expression of ID3, a member of the HLH family of transcription factors, is downregulated during RA-induced differentiation, and run-on transcription experiments demonstrated that this effect was transcriptional. Other ID's, like ID1 and ID2, that were expressed at lower levels in SH-SY5Y cells, were equally downregulated by RA. The levels of ID proteins decreased in parallel to the observed transcriptional repression. The expression of other bHLH genes changed during RA-induced differentiation: the expression of neuroblast-specific ASCL1 (HASH-1) gene was promptly reduced after RA treatment, whereas the expression of differentiation-promoting genes NEUROD6 (NEX-1, HATH-2) and NEUROD1 was increased. Our hypothesis is that ID's block cell differentiation by interfering the action of the neurogenic HLH transcription factors, and that RA released that block by downregulating ID's gene expression. Treatments with TPA, another inducer of neuroblastoma cell differentiation, also resulted in coordinated downregulation of the ID gene expression, underscoring the role of ID genes in differentiation. Downregulation of the ID gene expression by RA involves a complex mechanism, since full transcriptional repression required newly synthesized proteins and signaling by the Phosphatidylinositol-3 kinase. RA treatment activates the Phosphatidylinositol-3 kinase/Akt signaling pathway, resulting in increased Phosphatidylinositol-3 Kinase activity in extracts from RA-treated cells and a rapid increase in phosphorylation of Akt in Ser473. Inhibition of Phosphatidylinositol-3 kinase by LY294002 impaired RA-induced differentiation, as assessed by morphological and biochemical criteria. We propose that RA, by activating the Phosphatidylinositol-3 kinase/Akt signaling pathway, plays an important role in the regulation of the neuronal cell survival.