RESUMEN El estudio de las acciones del ácido retinoico (RA) en células de neuroblastoma posee dos vertientes de interés. En primer lugar, el RA es una señal que desempeña un papel central en el desarrollo embrionario y la generación de diversos órganos y sistemas, incluyendo el sistema nervioso, y por lo tanto hay un interés científico en conocer los mecanismos moleculares por los cuales ejerce estas acciones. En segundo lugar, el RA y sus derivados sintéticos están siendo ensayados en terapia de enfermedades neoplásicas, debido a su capacidad de regular el crecimiento, la diferenciación y la supervivencia celular, con resultados clínicos muy relevantes, como en el caso del neuroblastoma. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los que el RA ejerce sus acciones terapéuticas no han sido establecidos claramente. El objetivo de esta tesis ha sido descifrar los mecanismos moleculares por los que el RA induce la diferenciación de células neurales, utilizando como sistema modelo células de neuroblastoma. Resultados previos del laboratorio indican que, en células de neuroblastoma, la respuesta a la administración de RA no sólo se produce a nivel transcripcional, sino que también produce la activación de la ruta de señalización de PI3K/AKT (López-Carballo, G. 2002. J Biol Chem 277, 25297-25304). Esta activación es necesaria para la inducción de la diferenciación por RA y pensamos que ocupa un lugar central en el control ejercido por RA sobre el crecimiento, diferenciación y supervivencia celular, por lo que hemos llevado a cabo su caracterización con más detalle. A través del estudio de los aspectos mecanísticos de la activación de la vía de señalización de PI3K/AKT por RA, hemos determinado que la activación de las vías PI3K/AKT y MAPK/ERK por RA se produce a través de un mecanismo no genómico, que no requiere ni transcripción de nuevos genes ni síntesis de proteínas. Además, hemos demostrado que esta activación no es exclusiva de células de neuroblastoma, sino que es un proceso más general. Se ha establecido la participación del Receptor Nuclear RAR en la activación de la vía de señalización de PI3K/AKT, y hemos caracterizado qué dominio del receptor RAR está involucrados en la activación de la vía de PI3K/AKT. Además hemos puesto de manifiesto que la localización intracelular de RAR desempeña un importante papel en la activación de PI3K, y hemos descrito las interacciones físicas entre el receptor RAR y componentes de la vía de transducción de señal PI3K/AKT y cómo la unión de RA al receptor RAR regula estas interacciones. Finalmente, hemos analizado las consecuencias transcripcionales de estas acciones no genómicas del RA en células de neuroblastoma mediante el uso de microarrays de DNA. Los resultados obtenidos permiten plantear un nuevo modelo para la activación de la vía PI3K/AKT por RA en el que la unión del ligando al receptor nuclear RAR desempeña un papel central en la regulación de la localización intracelular de RAR y de la interacción de RAR con las subunidades de PI3K. __________________________________________________________________________________________________

Administration of Retinoic Acid (RA) to SH-SY5Y neuroblastoma cells results in activation of phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) signalling pathway, and this activation is required for RA-induced differentiation. Here we show that RA activates PI3K and ERK1/2 MAP Kinase signalling pathways through a rapid, non-genomic mechanism that does not require new gene transcription or newly synthesized proteins. Activation of PI3K by RA appears to involve the nuclear receptor RAR, on the basis of the pharmacological profile of the activation. In addition, activation of PI3K in RA-treated COS-7 cells was strongly increased by transfection of a RAR expression vector. The intracellular localization of RAR resulted to be relevant for PI3K activation. A chimerical RAR receptor fusing c-Src myristylation domain to the N-terminal of RAR (Myr-RAR) was targeted to plasma membrane. Transfection of Myr-RAR to COS-7 cells results in strong activation of PI3K signalling pathway, although both in the absence as well in the presence of RA. This result would argue for a role of ligand binding in the localization of RAR to plasma membrane, allowing there interactions with components of the signal transduction machinery that result in PI3K activation. By means of biochemical fractionation experiments we demonstrated that the levels of RAR in the membrane fractions (microsomal and purified plasma membrane fractions) were rapidly increased upon RA administration to NIH-3T3 cells. Immunoprecipitation experiments showed a physical interaction between RAR and p85, the regulatory subunit of PI3K, both in the absence as well in the presence of RA. Ligand administration increased the association of p110, the catalytic subunit of PI3K, to this complex. The results shown here suggest a model in which RAR forms a stable complex with p85-PI3K. Ligand binding to RAR promotes targeting of this complex to plasma membrane, facilitating the association with p110-PI3K and resulting in increased PI3K activity.