RESUMEN La Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco) cataliza el primer paso en la fijación fotosintética del CO2 a través del ciclo de Calvin. La estructura del holoenzima activo en organismos eucariotas es un hexadecámero compuesto por 8 subunidades grandes (de 51-58KDa) y 8 subunidades pequeñas (de 12-18KDa). En condiciones de senescencia natural o inducida por estrés la Rubisco sufre una degradación rápida y selectiva. Una de las respuestas más generalizadas ante diferentes tipos de estrés en distintos organismos es la oxidación de grupos tioles de la Rubisco, que se ha relacionado in vitro e in vivo con la inactivación y susceptibilización proteolítica del enzima. Los residuos de cisteínas filogenéticamente conservados de la Rubisco son candidatos potenciales a mediar esta regulación redox. Con estos antecedentes, el objetivo general del presente trabajo ha sido evaluar la implicación de los residuos Cys172 y Cys192 (altamente conservados en eucariotas y cianobacterias) en la actividad, modulación redox, y en la organización estructural del holoenzima. Para ello se han abordado los siguientes aspectos: I. Obtención y caracterización de las Rubiscos mutantes C172S, C192S y C172S/C192S Las funciones de los residuos Cys172 y Cys192 se han investigado estudiando el fenotipo de mutantes en los que dichos residuos se han sustituido por serina mediante mutagénesis dirigida del gen rbcL en el alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. El enzima C172S posee un factor de especificidad mayor que el silvestre, con unas constantes aparentes de Michaelis para el CO2 y O2 aumentadas. La Rubisco C192S presenta una especial sensibilidad a la inactivación por agentes modificadores de grupos sulfhidrilo. Ello parece responder al carácter crítico de la modificación de la Cys172 en la actividad enzimática y al efecto protector que sobre este residuo ejerce la Cys192. El estudio del ensayo de la sensibilidad térmica, de los cambios en la sensibilidad proteolítica y de la movilidad del holoenzima en geles nativos indica que la sustitución de las Cys172 y/o Cys192 afecta a la estructura de los enzimas. II. Determinación de la estructura de las Rubiscos C172S y C192S por difracción de rayos X Se ha determinado la estructura tridimensional de la Rubisco de los mutantes C172S y C192S. Como diferencia más significativa se ha detectado un desplazamiento de la hebra β1 del barril α/β en el enzima C172S en relación a la estructura del enzima silvestre. III. Estudio de la respuesta de los mutantes a diferentes tipos de estrés El mutante C172S sometido a estrés salino degrada la Rubisco de forma más lenta que la cepa silvestre o los demás mutantes. Además, bajo un estrés por diamida específicamente dirigido a la oxidación de los grupos sulfhidrilo, el mutante C172S se muestra resistente a la inactivación que sufren las demás cepas. Ello apunta a un papel singular del residuo Cys172 en la modulación del catabolismo de la Rubisco en respuesta a situaciones de estrés. En condiciones de estrés por diamida, todas las cepas mutantes (C172S, C192S y C172S/C192S) presentan una degradación retardada de la Rubisco por comparación con la cepa silvestre. Ello sugiere que, en estas condiciones de oxidación directa de los tioles celulares, la formación de un puente disulfuro entre la Cys172 y la Cys192 podría actuar como una señal condicionante de la degradación del enzima. __________________________________________________________________________________________________

Cysteines 172 and 192 from the large subunit of the photosynthetic enzyme ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) are a pair of vicinal residues evolutively conserved among cyanobacteria, algae and higher plants. In the present study, it has been analyzed the effect of the substitution of Cys172 and Cys192 by serine on the catalytic properties, thermostability, three-dimensional structure of the mutant enzymes, and the in vivo turnover and inactivation of Rubisco enzymes in stressed cells. 1. Site-directed mutagenesis of conserved cysteine residues (Cys172 and Cys192) of Rubisco in Chlamydomonas reinhardtii and Rubisco mutants characterization. The most remarkable effect of the C172S mutant was a 15% increase in the value of the specificity factor compared to the wild-type enzyme, while the specificity factor of C192S Rubisco was identical to wild-type. The C192S enzyme was more sensitive to inactivation through oxidation of cysteines than the wild type and the rest of the enzymes. The results suggest that the Cys192 protects the critical modification of the Cys172. The results of thermal stability, proteolytic susceptibility assays and holoenzyme mobility in native electrophoresis show that the substitution of Cys172 and/or Cys192 affect to the enzyme structure. 2. Crystallization and Structure determination of C172S and C192S Rubisco mutants. X-ray structures of the mutant enzymes reveal that the substitution at position 172 causes a significant shift of the main chain backbone atoms of β-strand1 of the α/β-barrel. 3. In Vivo turnover and inactivation of the C172S, C192S, C172S/C192S and wild-type Rubisco Enzymes in stressed Cells. The absence of Cys172 protects Rubisco from degradation under saline stress conditions. The C172S mutant enzyme is more resistant to inactivation under oxidative (diamide induced) stress. In a oxidative conditions (diamide stress) Cys172-Cys192 disulfide bond formation could act as a redox signaling pathway.