RESUMEN La apoptosis es una forma de muerte celular fisiol¨®gica con un papel esencial en el desarrollo de los tejidos, su homeostasis, en la respuesta inmune y en la regulaci¨®n hormonal. Cambios en el mecanismo apopt¨®tico est¨¢n asociados con la fisiopatolog¨ªa del c¨¢ncer, SIDA y enfermedades neurodegenerativas. El mecanismo bioqu¨ªmico del proceso apopt¨®tico no se conoce en su totalidad. La generaci¨®n de radicales libres del ox¨ªgeno (ROS) parecen tener un papel importante en este proceso. La XOR representa una importante fuente de radicales libres tanto de ox¨ªgeno (ROS), como de nitr¨®geno (RNS), a nivel del endotelio capilar, en enterocitos del intestino delgado proximal, en hepatocitos y en las c¨¦lulas alveolares pulmonares. La XOR es la enzima clave en el catabolismo pur¨ªnico, catalizando la oxidaci¨®n de la hipoxantina a xantina, y de la xantina a ¨¢cido ¨²rico. La enzima con localizaci¨®n citoplasm¨¢tica en distintos tejidos, es una molibdoflavoproteina con un peso molecular de 300kDa. A la XOR se le atribuye un papel antimicrobiano y antiviral, es una componente importante del sistema inmune inespec¨ªfico, es capaz de reducir al citocromo c. Interviene en los procesos de fagocitosis, inmovilizaci¨®n del Fe y en lactogenesis. La actividad de la enzima se ha detectado en la leche humana y en la leche de varios mam¨ªferos. Se sabe que la XOR se produce en la gl¨¢ndula mamaria, pero los est¨ªmulos end¨®genos y el mecanismo molecular responsable de su expresi¨®n todav¨ªa no se conocen. La primera parte de la tesis muestra el papel de la XOR durante la involuci¨®n fisiol¨®gica en la gl¨¢ndula mamaria de rata, que se realiza debido a un proceso apopt¨®tico. Se muestra el mecanismo por el cual la XOR controla distintas v¨ªas implicadas en apoptosis tras el destete. Durante la involuci¨®n de la gl¨¢ndula mamaria, la digesti¨®n del DNA tiene lugar a las 12 horas tras el destete. La oxidaci¨®n del GSH precede la degradaci¨®n del DNA nuclear, el estr¨¦s oxidativo mitocondrial tiene un papel importante en la inducci¨®n del proceso apopt¨®tico. 2 Existe un aumento significativo de la actividad de la XO 24 horas tras el destete. El incremento de dicha actividad enzim¨¢tica es debido a un aumento en la actividad proteol¨ªtica, de la actividad de las caspasas. El alopurinol administrado disminuye de forma significativa la actividad de la XOR, su inhibici¨®n determina una disminuci¨®n de la apoptosis en el tejido glandular. El cociente GSSG/GSH disminuye en la sangre y en el tejido mamario. Existe una correlaci¨®n positiva entre la nitraci¨®n de las prote¨ªnas y el porcentaje de c¨¦lulas apopt¨®ticas cuando la actividad de la enzima XO es m¨¢xima. El JNK y el p38, prote¨ªna kinasas activadas por el estr¨¦s durante la apoptosis, se fosforilan tras el destete. La expresi¨®n el p53, un gen proapopt¨®tico es evidente. En la segunda parte del trabajo se muestra la localizaci¨®n mitocondrial de la XO y su implicaci¨®n el la v¨ªas intr¨ªnseca de la apoptosis durante la involuci¨®n de la gl¨¢ndula mamaria de rata. Despu¨¦s del aislamiento de mitocondrias se ha detectado la expresi¨®n de la XO por la t¨¦cnica de Western Blot y su actividad mitocondrial. Estos resultados muestran que la localizaci¨®n de la XO en la mitocondria representa una nueva fuente de ROS y RNS. La administraci¨®n del alopurinol disminuye la salida del citocromo c de la mitocondria durante la apoptosis, a 12 horas tras el destete. Por lo tanto la XO mitocondrial representa una clave importante en el control de la apoptosis. __________________________________________________________________________________________________

Apoptosis is an active physiological cell death that controls cell populations during embryogenesis, immune response, hormone regulation, and normal tissue homeostasis. Several reports have emphasized the role of oxidative stress and nuclear DNA damage in apoptosis. Xanthine OxidaseReductase (XOR) is one of the major sources of reactive oxygen and nitrogen species (ROS, RNS) which is particularly present at the level of capillary endothelial cells, low but measurable amounts or XOR activity are found in various other cell types. XOR is produced in the mammary gland, however, the refined cellular localization, the endogenous stimuli and the molecular mechanisms responsible for the expression of XOR in mammary gland are yet known. In the first part of my thesis I show the role of XOR in apoptosis in mammary gland tissue in rat after weaning. During mammary gland involution, DNA digestion takes place at 12 h after weaning and the glutathione oxidation precedes nuclear DNA degradation. Mitochondrial oxidative stress plays a key role in the induction of the apoptotic process. There is a significant increase in XO activity at 24 h after weaning. The increase in XO activity could cause by an increased proteolytic activity in the mammary gland, due to increased caspase activity. Allopurinol administration decreased significantly XO activity and its inhibition induces a decrease in apoptosis. During apoptosis in the mammary gland XO activity rose and the GSSG/GSH ratio in blood and mammary gland increased. There was a positive correlation between protein nitration and percentage of apoptosis when XO activity was higher. JNK and p38, stress activated protein kinases involved in apoptosis, were phosphorylated during weaning. The expression of p53 and NF¦ÊB were induced too. XO controls the p53 and NF¦ÊB expression to the first period of involution and p38 activity at 48h after weaning. In the second part of the thesis I tried to demonstrate the possible localization of XO in the mitochondria and its implication during the intrinsic pathway of apoptotic process during the involution of the rat mammary gland.