http://hdl.handle.net/10550/168 Thu, 23 May 2013 02:51:26 GMT 2013-05-23T02:51:26Z http://hdl.handle.net/10550/27945 Validación clínica de un sistema de análisis de imagen : aplicación del time-lapse en el análisis de marcadores morfocinéticos de desarrollo a blastocisto e influencia del método de fecundación y calidad seminal sobre la cinética de desarrollo embrionario Cruz Palomino, María Garrido Puchalt, Nicolás; Meseguer Escrivá, Marcos Departament de Bioquímica i Biologia Molecular La incapacidad de estimar con precisión el potencial reproductivo de cada embrión individualmente deriva en un elevado porcentaje de gestaciones múltiples. Los sistemas de clasificación embrionaria basados en la morfología y en las tasas de división han sido los pilares sobre los que se ha asentado la evaluación embrionaria; desafortunadamente, estos métodos no son lo suficientemente precisos como para garantizar el éxito a las pacientes y a los clínicos a reducir el número de embriones transferidos. Dada la situación de incertidumbre asociada a la inspección morfológica en las primeras etapas de desarrollo, algunos centros de reproducción han optado por el cultivo prolongado para evaluar la competencia embrionaria; sin embargo, el transfer de blastocistos, a pesar de mejorar las tasas de implantación, implica extender la duración del cultivo in vitro lo que eleva las posibilidades de alteración de la expresión génica y de la herencia epigenética Las limitaciones de los criterios morfológicos de selección embrionaria han conducido al desarrollo de nuevas tecnologías con el propósito de conocer el potencial reproductivo de un embrión en concreto. Por lo tanto, la búsqueda de un test objetivo y fiable que evalúe la viabilidad tanto del ovocito como del embrión y que conduzca a un descenso en las tasas de gestación múltiple mientras se mantienen las tasas globales, se ha convertido en uno de los desafíos más importantes de la medicina reproductiva contemporánea. La comprensión de la dinámica estructural de la maquinaria molecular y celular de los organismos vivos se ha convertido en uno de los principales objetivos de la investigación biológica en la era post-genómica. El conocimiento detallado de las relaciones espacio-temporales entre células en el contexto de unas funciones fisiológicas concretas puede emplearse en mejorar los resultados de los tratamientos de reproducción asistida; evidentemente, las secuencias de imágenes desempeñan un papel importante en la adquisición de este conocimiento. En las dos últimas décadas se han realizado enormes progresos en el desarrollo de herramientas informáticas asociadas a los microscopios y en la metodología de visualización de alta especificidad. Todos estos avances han conducido a un aumento explosivo en la adquisición de imágenes digitales para los estudios biológicos. Las técnicas de análisis de imagen añaden objetividad a los procesos de selección embrionaria, y en consecuencia, permiten mejorar los resultados de los tratamientos de Reproducción Asistida. La valoración cuantitativa de los aspectos clave de la morfología embrionaria y el almacenamiento de los datos relacionados con estas determinaciones pueden usarse para mejorar nuestro conocimiento acerca del desarrollo embrionario temprano y conducir hacia sistemas de clasificación morfológica mucho más sofisticados. Los esfuerzos cada vez más intensos dirigidos hacia la implantación de una política de transferencia de un único embrión conducen al desarrollo de nuevas estrategias cuyo objetivo es optimizar el poder predictivo de la viabilidad embrionaria. Una de estas maniobras en el establecimiento de nuevos marcadores de selección es la observación de la variabilidad en los tiempos de división; dada su facilidad de aplicación y su naturaleza no subjetiva, gran parte de la investigación reciente se centra en explorar su utilidad como marcadores de competencia embrionaria. Sabemos que el tiempo transcurrido entre la fecundación y la primera división es un parámetro objetivo y fácil de determinar con cierto valor predictivo de la viabilidad embrionaria; a pesar de que la relación entre el estadío de desarrollo y número de células se conoce desde hace tiempo, la valoración de la división temprana y su importancia en los procedimientos de selección embrionaria es relativamente reciente. El fenómeno de la división temprana y su impacto sobre las tasas de gestación es estudiado por primera vez por Edwards ; a partir de este momento se publican numerosos estudios en los que el punto de partida es la idea de que la transferencia de embriones con división temprana mejora las tasas de gestación e implantación. Por lo tanto, podemos asumir que el estudio de la cinética de desarrollo ayuda a discriminar entre embriones de similares características morfologicas potenciando las diferencias evolutivas e implantatorias existentes entre ellos. Sin embargo, por las propias características derivadas de las condiciones de cultivo, el seguimiento del desarrollo embrionario es intermitente por lo que podemos acabar perdiendo precisión en los resultados relacionados con las divisiones embrionarias; la fijación arbitraria de los tiempos de observación del desarrollo embrionario puede derivar en cierta confusión a la hora de categorizar el estadío y la cronología del desarrollo. Con la introducción del time-lapse y del análisis digitalizado de las imágenes, no solo obtenemos una visión completa del desarrollo embrionario sino que podemos determinar con total precisión los tiempos de división embrionaria y cualquier fenómeno intracelular circundante a la fecundación Los resultados de este trabajo validan la utilidad de un dispositivo de análisis de imagen en la práctica diaria de un laboratorio de Reproducción al mismo tiempo que se establece la capacidad de la cinética de desarrollo embrionario para predecir la posterior capacidad para evolucionar a blastocisto; también se concluye la influencia del método de fecundación y de la calidad seminal en la tasa de división embrionaria Sat, 31 Dec 2011 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10550/27945 2011-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/10550/27944 Identificación y caracterización de precursores mesodérmicos con capacidad hematopoyética en el tejido adiposo humano Navarro Soriano, Amparo Miñana Giménez, María Dolores Departament de Farmacologia La fracción vascular estromal (FVE) del tejido adiposo humano contiene precursores mesodérmicos con capacidad de generar in vitro unidades formadoras de colonias hematopoyéticas (CFUs) y colonias mixtas de células hematopoyéticas y endoteliales. El trabajo realizado en esta tesis doctoral ha tenido como objetivo el estudio de estos progenitores hematopoyéticos. Para ello, se aislaron las diferentes subpoblaciones celulares que componen la FVE y tras su caracterización inmunofenotípica, se determinó su capacidad formadora de CFUs y la expresión de los principales factores de transcripción implicados en la hematopoyesis. Para estimar la ontogenia de los progenitores hematopoyéticos contenidos en la FVE, se estudiaron los progenitores eritroides. Para ello, las colonias eritroides derivadas de las unidades formadoras de brotes eritroides (BFU-E), desarrolladas en medio semisólido y en diferentes condiciones de cultivo, se caracterizaron en términos de expresión de hemoglobina y genes de las globinas. Por último se valoró la capacidad angiogénica de las células CD45- y CD45+ de la FVE, mediante uso de un modelo de angiogénesis in vivo con implantes subcutáneos de Matrigel y se comparó con la de las células mesenquimales generadas en cultivo a partir de las células CD45- de la FVE. Los resultados obtenidos sugieren fuertemente que la FVE del tejido adiposo humano contiene progenitores hematopoyéticos diferentes de los circulantes en sangre, y por lo tanto no deben tener su origen en la médula ósea sino en el propio tejido adiposo. Además, demuestran que las células CD45+ de la FVE deben tener un papel muy importante en la angiogénesis fisiológica del tejido adiposo. Mon, 31 Dec 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10550/27944 2012-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/10550/27941 Función del gen PIR32 en la construcción y biogénesis de la pared celular de Candida albicans Moscardó Polop, Teresa Valentín Gómez, Eulogio Departament de Microbiologia i Ecologia Candida albicans es un hongo que forma parte de la microbiota comensal de los tractos urogenital y gastrointestinal de muchos individuos, no obstante es la especie que se encuentra con mayor frecuencia como patógeno humano y por ello es la más estudiada y utilizada como modelo de investigación con respecto a otras especies; además, la incidencia de infecciones producidas por Candida se ha incrementado en los últimos años observándose paralelamente un aumento significativo de la morbilidad y la mortalidad como consecuencia de estas infecciones. La pared celular es la característica diferencial más importante entre las células eucariotas humanas y fúngicas, lo cual la convierte en diana ideal para el ataque selectivo con fármacos que produzcan una menor toxicidad para los pacientes (Cassone, 2008). Por tanto el conocimiento de la síntesis, ensamblaje y conformación final que adquieren los componentes de la pared celular de C. albicans es uno de los aspectos más interesantes en el estudio de este hongo. La pared celular fúngica es la estructura más externa de la célula, y por tanto la primera que interacciona con el hospedador. Asimismo es responsable de la impermeabilidad, rigidez y de morfología característica de la célula. La pared celular no es una estructura inerte, si no que cumple importantes funciones metabólicas, como la regulación del flujo de sustancias a su través, o la detección primaria de cambios en el medio físico externo. En el caso de las levaduras patógenas oportunistas -cuyo ejemplo es el organismo que nos ocupa,- la pared participa en el reconocimiento específico y adhesión a los tejidos del hospedador (Marcilla et al., 1998; Ruiz- Herrera et al., 2006). De esta manera el estudio de proteínas integrales de la pared en este sentido tiene una doble importancia: básico como modelo de diferenciación celular simple, y aplicado en la ampliación de tratamientos contra las infecciones por C. albicans. Es por ello que se ha profundizado en el estudio de la pared celular de C. albicans, debido a su gran repercusión e importancia clínica. El interés inicial de las proteínas Pir radica en la importancia demostrada de esta familia en S. cerevisiae. En trabajos previos se observó que la disrupción conjunta de los cuatro genes pertenecientes a la familia Pir de S. cerevisiae producía células morfológicamente muy alteradas y poco viables, demostrando la esencialidad de esta familia de proteínas (Ecker et al., 2006). Estudios realizados en nuestro grupo de investigación demostró la no esencialidad del gen PIR1 en C. albicans (Micó, 2009), lo que podía indicar la presencia de otras proteínas Pir en este microorganismo. Dada la relevancia de esta familia de proteínas Pir en S. cerevisiae, y como continuación de los estudios realizados por nuestro grupo de investigación en los últimos años, nos planteamos la búsqueda de nuevas proteínas Pir en C. albicans. El análisis in silico reveló la presencia del gen PIR32. En la presente Tesis Doctoral se ha procedido al estudio de la importancia de este gen en la biología de C. albicans, así como la localización y funcionalidad de la proteína Pir32 en la arquitectura e integridad de la pared celular. La información obtenida de los resultados derivados de esta Tesis Doctoral ha contribuido a mejorar la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la formación y composición de una estructura tan importante como es la pared celular de C. albicans, además de permitir conocer el papel de Pir32p en la virulencia de la célula y la detección de dianas potenciales para el desarrollo de nuevos compuestos antifúngicos y antígenos que podrían ser útiles en el desarrollo de técnicas inmunológicas para la detección precoz de la candidiasis. Mon, 31 Dec 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10550/27941 2012-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/10550/27936 PACo: a Novel procrustes application to cophylogenetic analysis Míguez-Lozano, Raúl; Blasco Costa, María Isabel; Balbuena, Juan Antonio We present Procrustean Approach to Cophylogeny (PACo), a novel statistical tool to test for congruence between phylogenetic trees, or between phylogenetic distance matrices of associated taxa. Unlike previous tests, PACo evaluates the dependence of one phylogeny upon the other. This makes it especially appropriate to test the classical coevolutionary model that assumes that parasites that spend part of their life in or on their hosts track the phylogeny of their hosts. The new method does not require fully resolved phylogenies and allows for multiple host-parasite associations. PACo produces a Procrustes superimposition plot enabling a graphical assessment of the fit of the parasite phylogeny onto the host phylogeny and a goodness-of-fit statistic, whose significance is established by randomization of the host-parasite association data. The contribution of each individual host-parasite association to the global fit is measured by means of jackknife estimation of their respective squared residuals and confidence intervals associated to each host-parasite link. We carried out different simulations to evaluate the performance of PACo in terms of Type I and Type II errors with respect to two similar published tests. In most instances, PACo performed at least as well as the other tests and showed higher overall statistical power. In addition, the jackknife estimation of squared residuals enabled more elaborate validations about the nature of individual links than the ParaFitLink1 test of the program ParaFit. In order to demonstrate how it can be used in real biological situations, we applied PACo to two published studies using a script written in the public-domain statistical software R. Mon, 31 Dec 2012 23:00:00 GMT http://hdl.handle.net/10550/27936 2012-12-31T23:00:00Z