http://hdl.handle.net/10550/171 2013-06-18T05:58:27Z http://hdl.handle.net/10550/28710 Aislamiento, cultivo, caracterización y maduración de células indiferenciadas desde biopsias testiculares humanas Riboldi, Marcia Simón Vallés, Carlos Departament de Pediatria, Obstetrícia i Ginecologia En el testículo existe una población de células pluripotentes, las Espermatogonias Stem Cells (SSC), responsables de la autorrenovación y la diferenciación, manteniendo así la espermatogénesis. La espermatogénesis es el proceso en el cual la espermatogonia sufre una serie de divisiones hasta originar el espermatozoide, que son las células fundamentales para transmitir la información genética a las generaciones futuras. Recientemente, han sido publicados una serie de estudios mostrando la posibilidad de generar células pluripotentes a partir de biopsias testiculares humanas de individuos adultos (Conrad et al., 2008; Kossack et al. ,2008). Los resultados obtenidos en éstos trabajos en humanos parecen indicar que las células obtenidas de las biopsias testiculares (las espermatogonias) sufren una reprogramación en cultivo, pasando a expresar marcadores embrionarios y pudiéndose diferenciar a las tres capas germinales y formar teratomas. En el presente proyecto proponemos demostrar la generación de líneas celulares de espermatogonias humanas desde las biopsias testiculares diagnósticas realizadas rutinariamente a pacientes con azoospermia obstructiva. Se trata de demostrar la prueba de concepto para su aplicación clínica en la preservación de la fertilidad en los niños que debido a su tratamiento oncológico deben recibir quimio/radioterapia resultando en la detención de la espermatogénesis. Para ello, se obtendrán líneas de espermatogonias autólogas mediante biopsia previa a su tratamiento oncológico, para luego después de su curación, ser inyectadas en testículo con el fin de recuperar la espermatogénesis en aquellos casos que se hubiera destruido. Durante el periodo de 2009-2010, se han recogido cerca de 50 muestras de biopsias testiculares de pacientes sometidos a tratamientos de Fertilización in vitro (FIV) en la Clínica IVI - Valencia. Las biopsias son realizadas con el objetivo de encontrar espermatozoides para el tratamiento de la infertilidad (ICSI). El material restante de las biopsias es donado mediante un consentimiento informado firmado por los pacientes. La muestra es transportada en hielo hasta en laboratorio , donde se empieza la digestión del material con el uso de enzimas. En primer lugar, realizamos el cultivo de células de Sertoli y a continuación, se lleva a cabo una incubación de 96 horas con factores que mantienen un ambiente favorable para la supervivencia de las espermatogonias. Tras ese período, se purifica la muestra con la utilización del anticuerpo CD49f (Conrad et al., 2008) presente en las células adheridas a la membrana basal de los túbulos seminíferos (espermatogonias). Por último, las células positivas son sembradas y mantenidas en cultivo con diferentes medios a los que se le añaden factores (GDNF, b-FGF, LIF) que mantienen la indiferenciación celular. Las líneas obtenidas poseen características similares: - Expresión de los marcadores de pluripotencia: OCT4, NANOG, SOX2 (determinado por PCR) - Expresión de los marcadores de células germinales: c-Kit, STELLA, BOULE, BLIMP1(determinados por PCR) - Ausencia de expresión de los marcadores de células germinales: GAF, VASA, DAZL, PIWIL2, PRM1, TNP2 (determinados por PCR) - Expresión de los marcadores de espermatogonias: CD49f, Thy-1 (CD90), GPR125, SSEA-1 (determinados por PCR e inmunocitoquímica) - Cultivo de Clusters celulares (medio serum-free + factores) - Microscopia Electrónica: análisis de los clusters en cultivo - Análisis del Cariotipo celular: Normal (46, XY) - FISH: presencia de 90% de células 2n. - Purificación de las células de Sertoli con Nile Red en el Cell SORTER - Análisis de Citometria: Nile Red positivas - Inmunocitoquímica: Oil Red positivas - Expresión de los marcadores de células de Sertoli: WT1, GATA-4 (determinados por PCR) - Ausencia de expresión del receptor hormonal: rFSH (determinado por PCR) - Transfección de las Líneas celulares con la proteína GFP/RPF. Con la obtención de líneas celulares de espermatogonias y células de Sertoli a partir de biopsias testiculares humanas de individuos adultos y el cultivo in vitro en laboratorio, hemos podido establecer un protocolo para aislar éstas células y mantenerlas en un ambiente favorable para su crecimiento y mantenimiento. Posteriormente, empezaremos los experimentos de co-cultivo celular, cultivando las células de Sertoli sobre una matriz de colágeno para dar base a su crecimiento, añadiremos las espermatogonias, además de hormonas como FSH y testosterona, para probar la capacidad de división celular que éstas células poseen in vitro (espermatogénesis). 2012-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/10550/28554 Nuevas estrategias farmacológicas en el tratamiento de la psoriasis Andrés Ejarque, Rosa María Terencio Silvestre, María del Carmen; Montesinos Mezquita, Mª Carmen; Payá Peris, Miguel Departament de Farmacologia La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por la inflamación de la piel, que viene acompañada por hiperproliferación de los queratinocitos, infiltración leucocitaria dérmica y una angiogénesis incrementada. Los mecanismos patológicos que dirigen esta patología incluyen tanto respuestas de la inmunidad innata como de la adaptativa. En la presente tesis doctoral se ha ahondado en el estudio de la respuesta fisiopatológica de los queratinocitos a los cambios que se producen en el entorno de una placa psoriásica, con el objetivo de aportar evidencia de relevancia para el desarrollo de nuevos tratamientos farmacológicos. De este modo, se ha puesto de manifiesto que los mediadores proinflamatorios presentes en el contexto psoriásico son capaces de alterar la expresión de los receptores de adenosina, nucleósido implicado en el efecto antiinflamatorio del metotrexato, produciéndose una disminución de los receptores A2B y un aumento de los A2A. Así mismo, se ha demostrado que en piel psoriásica lesional existe una sobreactivación de los transductores de señales y activadores de la transcripción (STAT) 1 y 3, pese a que se produce una disminución mayoritaria de la expresión de las Janus cinasas (Jak). Además, se ha caracterizado el papel de diversos mediadores proinflamatorios en la modulación de estas vías de señalización. Recientemente se ha puesto de manifiesto la importancia de STAT3, así como del factor de transcripción nuclear κB (NF-κB) en la patogénesis de la psoriasis. Por ello, y con el fin de obtener nuevos fármacos útiles para el tratamiento de la enfermedad, en la presente tesis hemos evaluado el potencial efecto antipsoriásico de diversos derivados de origen natural en base a su capacidad para inhibir la activación de estos dos factores de transcripción. Para ello, iniciamos nuestro estudio mediante un screening previo en la línea de macrófagos murinos RAW 264.7 de una serie de moléculas obtenidas en su mayoría de esponjas marinas, así como del condroitín sulfato (CS), proteoglicano de amplio uso en la terapéutica de la osteoartritis. La siguiente fase de nuestro proceso de cribado se realizó en cultivos primarios de queratinocitos humanos, en los que se evaluó la capacidad para inhibir la liberación de las citocinas factor de necrosis tumoral α (TNFα) e interleucina (IL)8. Estos estudios preliminares nos llevaron a la selección del derivado semisintético 4-Benzo[b]tiofen-2-il-3-bromo-5-hidroxi-5H-furan-2-ona (BTH) y del CS para su estudio en profundidad. En la última fase de nuestro estudio, el pretratamiento de queratinocitos primarios humanos con el CS inhibió la activación del NF-κB y, en consecuencia, la liberación de citocinas proinflamatorias. Además, disminuyó la translocación al núcleo de STAT3 así como su actividad transcripcional, demostrando su potencial interés como nuevo fármaco antipsoriásico. Por otro lado, el derivado semisintético BTH también disminuyó la liberación de citocinas y quimiocinas proinflamatorias gracias a su efecto inhibidor de la activación del NF-κB. Además, disminuyó la activación de STAT3 a través del bloqueo de la fosforilación en el residuo de tirosina 705 (Tyr705). Estos resultados fueron confirmados in vivo mediante dos modelos de psoriasis en ratón: la hiperplasia epidérmica inducida por 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) y la inflamación psoriásica inducida por imiquimod. En ambos modelos, la administración tópica del BTH previno el desarrollo de lesiones psoriásicas a través de la supresión de la fosforilación del NF-κB y el STAT3, confirmando el potencial de esta molécula como nuevo fármaco antipsoriásico. Globalmente, la presente tesis arroja nueva luz sobre el papel de la adenosina y las vías de señalización del NF-κB y el STAT3 en la patogénesis de la psoriasis y pone de manifiesto la eficacia de moléculas sencillas de origen natural en la paliación de su curso, sugiriendo el potencial interés de estas estrategias farmacológicas en el desarrollo de nuevos abordajes terapéuticos para el tratamiento de esta enfermedad. 2012-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/10550/28498 Manejo de schwannoma vestibular con radiaciones : experiencia del IVO Arribas Alpuente, Leoncio Alfonso Roldán Badía, Pedro; Arana Fernández de Moya, Estanislao Departament de Cirurgia A partir de la década de los 70, nace la radiocirugía (RC) como tratamiento alternativo a la cirugía convencional en el tratamiento de los schwannomas vestibulares(SV). Poco a poco dicha técnica, ha ido desbancando a la microcirugía alcanzando cifras del 58 % de tratamientos de RC frente a la cirugía convencional. En el presente estudio analizamos el resultado de 167 tumores tratados con radiaciones (bien con dosis única (RC) o con dosis fraccionada, RT Estereotáctica Fraccionada (RTEF), determinando el control local y las complicaciones como tratamiento del SV. Analizamos los resultados en función de la tecnología utilizada para tratarlos, bien colimadores cilíndricos o bien micromutiláminas. Los objetivos primarios son evaluar el control local y la aparición de complicaciones agudas y crónicas, valorando la audición y su evolución tras el tratamiento con radiaciones. Los objetivos secundarios son realizar un análisis de los factores pronóstico de control local y complicaciones, comparar los resultados con otras series de radiocirugía, así como realizar un modelo matemático para obtener el volumen tumoral a partir de las dimensiones del tumor obtenidas en la RM. De febrero de 1997 a mayo de 2012 hemos tratado 194 pacientes diagnosticados de SV, de ellos 144 (74 %) fueron tratados directamente con radiaciones y en 50 (26 %) se decidió realizar seguimiento. De ellos el 58 % sigue en revisiones al no objetivar crecimiento tumoral y 21 (42 %) han sido tratados con radiaciones. Haciendo un total de 167 tumores en 165 pacientes tratados. Establecemos dos etapas de tratamiento en función de la tecnología utilizada la primera desde el inicio hasta abril de 2005 y la segunda desde mayo de 2005 hasta mayo de 2012. Las características de las mismas están reflejadas en la siguiente tabla: 1ª Etapa 2ª Etapa Marco de Estereotaxia Barcia-Salorio /Leksell Brainlab Acelerador Saturno 42 GE/Varian OncorSiemens Planificador 3 Dline Brainscan5.3/IPLAN Brainlab Fusión TC/RM cerebral Desde 2001 Automática Técnica de irradiación Arcoterapia dinámica Arcoterapia dinámica conformada Colimación del haz Colimadores cónicos Microcolimador multiláminas Brainlab Nº tumores tratados 103 64 Las limitaciones son las de todo estudio prospectivo, es decir falta de algún dato sobre todo en los primeros años, aunque a partir de 2002 existe una hoja de datos prospectiva que incluye los datos utilizados para la realización de la tesis. Existe una diferencia en el seguimiento de los pacientes de la primera etapa 9,3 años frente a la segunda, 2,4 años, estadísticamente significativo . El número de pacientes de cada etapa es diferente 103 frente a 64, lo que obliga a la utilización de análisis de supervivencia para poder realizar comparaciones entre las diferentes etapas. La media de edad es de 58 años, siendo de 60 años en la 1ª etapa frente a 55,7 años en la 2ª. La media del volumen es de 2,76 cc, siendo de 3,14 cc en la 1ª etapa y de 2,12 cc en la 2ª sin alcanzar una significación estadística. Sólo el 19 % de la serie mantiene la audición útil al diagnóstico. La audición era peor en la primera etapa frente a la segunda con diferenciación estadística. La sintomatología ha sido similar en ambas etapas destacando la hipoacusia, las alteraciones del equilibrio y los acúfenos. El nº de tumores relacionados con la neurofibromatosis (NF2) ha sido de 6, que representa el 3,6 % del total de la serie. El 86 % ha recibido tratamiento con radiaciones de manera exclusiva, el 14 % con combinaciones de cirugía y radiaciones. La media de dosis ha sido en las dos etapas de 12,4 Gy. El control local clínico (entendido como ausencia de necesidad de realizar otros tratamientos) ha sido del 97 % a 5 años en la serie global siendo del 96 % en la 1ª etapa y del 100 % en la 2ª etapa, a 10 años es del 95 % en la 1ª etapa. La recaída local es del 3 % (5 pacientes). El control local en tumores grandes (> de 30 mm, e con un volumen ≥ 8,5 cc en los 22 pacientes (13 % del global) es del 91 %, siendo del 86, 5 % con un seguimiento de 9,3 años, en la 1ª etapa frente al 100 % en la segunda con un seguimiento de 2,4 años. Los 6 tumores relacionados con la NF2, están controlados. Hemos recogido 15 complicaciones agudas y 30 crónicas. Entre las crónicas existen 9 complicaciones del n. facial, 2 permanentes (en la 1ª etapa) y 7 transitorias (4 en la 1ª etapa y 3 en la 2ª), 11 complicaciones del n. trigémino, 4 permanentes (3 en la 1ª etapa y 1 en la 2ª etapa) y 7 transitorias (6 vs 1). Hay 10 hidrocefalias +/- quiste aracnoideo ( 9 en la 1ª etapa y 1 en la 2ª etapa). La probabilidad de estar libre de cualquier tipo de complicaciones agudas y crónicas es del 89 % en el global de la serie ( 90 % en la 1ª etapa vs 85 % en la 2ª etapa a 5 años a 10 y 15 años es del 85 % en la 1ª etapa. La probabilidad de estar libre de exitus por tumor es de 98 % para el total de la serie, siendo del 97 % en la 1ª etapa vs 100 % en la 2ª etapa). El 68,7 % de los pacientes que mantienen la audición el día de la RC, la siguen conservando. No hemos recogido ninguna malignización tumoral ni ningún tumor radioinducido en toda la serie. En cuanto al modelo matemático para la determinación del volumen tumoral a partir de las dimensiones obtenidas en la RM (medidas latero-lateral, AP-PA y cráneo-caudal), hemos elegido una fórmula mixta contemplando la parte intracanalicular como un cilindro de 10 x 6 x 6 mm, la parte extracanalicular como una esfera de con unas dimensiones de APPA y CC similares a las obtenidas en la RM y una dimensión LL igual a LL menos 10 mm. Realizando las curvas de Bland Altman y el test de Pitman esta fórmula obtiene unas medidas muy próximas a las reales, obtenidas el día de la RC por el planificador. Hemos recogido 13 neoplasias en los 165 pacientes tratados, que dobla la media de tumores malignos esperados en dicha muestra. Este dato no ha sido publicado en los trabajos publicados sobre tratamientos de SV. Los datos obtenidos en este trabajo son similares a los obtenidos en las diferentes series publicadas de SV tratados con radiaciones, bien con RC o con RTEF. 2011-12-31T23:00:00Z http://hdl.handle.net/10550/28426 Procalcitonina y proteína c-reactiva como marcadores precoces de fuga anastomótica en cirugía colorrectal García-Granero García-Fuster, Alvaro Flor Lorente, Blas; García-Granero Ximénez, Eduardo; Espí Macías, Alejandro Departament de Cirurgia Objetivo: Evaluar si la procalcitonina (PCT) y la proteína C-reactiva (PCR) son buenos predictores de fuga anastomótica en cirugía colorrectal. Métodos: Se analizaron prospectivamente 205 pacientes consecutivos operados de forma programada en cirugía colorrectal a los cuales se les realizó una anastomosis intestinal. Se registraron los datos demográficos y quirúrgicos, ASA, POSSUM y las complicaciones postoperatorias. En los primeros cinco días tras de la intervención se realizó analítica diaria incluyendo hemograma, bioquímica, PCR y PCT y se registraron las constantes vitales. Las fugas anastomóticas fueron divididas en menores o mayores según la necesidad de tratamiento médico o tratamiento invasivo con drenaje percutáneo o reintervención. Resultados:17 (8,3 %) pacientes presentaron una fuga anastomótica; de estos, 11 (5,4 %) presentaron una fuga mayor (necesidad de re-operación o drenaje).Ninguno de los factores analizados (PCT, PCR, leucocitos, neutrófilos, temperatura, plaquetas, frecuencia respiratoria y cardiaca) demostraron ser variables fiables en la detección precoz de FA consideradas globalmente (área bajo de la curva ROC (ABC) < 0.800). Sin embargo, la PCT y la PCR medidas los días 3,4 y 5 postoperatorios resultaron ser indicadores fiables de fuga mayor (p< 0.0001 y ABC >0.8). La mejor combinación resultó ser la PCT medida al quinto día postoperatorio (ABC= 0.86) con un valor de corte de 0.31 ng/ml, qué presentó una sensibilidad del 100 %, una especificidad del 72%, un valor predictivo negativo del 100% y un valor predictivo positivo del 17%. Conclusiones: Los valores elevados de PCT y PCR los días postoperatorios 3º, 4º y 5º son indicadores de probable fuga anastomótica y obligarían a una atenta evaluación del paciente antes del alta. La normalidad de la concentración plasmática en estos días postoperatorios descartan el desarrollo de fuga anastomótica mayor y facilitarían el alta hospitalaria precoz con mayor seguridad. 2011-12-31T23:00:00Z